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1、猪肺炎支原体生长培养基的筛选李石1项目来源：新疆兵团农业科技重大攻关计划课题(2010GG04)2作者简介：李石（1988-），男，汉族，湖南郴州人，硕士研究生，研究方向：动物传染病的诊断与防治 Tel:15886938041,E-mail：3通讯作者：李劼（1965-），女，汉族，副教授，硕士，研究方向：动物传染病的诊断与防治 周霞（1968-），女，教授，博士，研究方向：动物传染病的诊断与防治，李劼*，周霞*(新疆石河子大学动物科技学院，石河子市832003)摘要：为了解猪肺炎支原体的培养特性，筛选出肺炎支原体生长的最适培养基，本实验采用颜色改变单位（CCU)法和PCR方法对猪肺炎支原体在
2、四种常用培养基及改良KM2培养基中生长情况进行了检测与比较。结果显示：本实验室改良KM2培养基为最适培养基，10天时颜色改变单位可达108CCU/mL。 关键词：猪肺炎支原体；培养基；筛选The screening of Mycoplasma hyopneumoniae growth mediumLi Shi,Li Jie*,Zhou Xia*(College of animal science and technology of shihezi university,Shihezi 832003,China)Abstract: In order to develop the culture
3、characteristics of Mycoplasma hyopneumoniae, pick out the most suitable medium, the color change unit (CCU) method and PCR method was used to test and compare the culture of swine mycoplasmal pneumonia cell number between four kinds of medium and improved KM2 medium. The results showed that: the imp
4、roved KM2 medium was the optimum medium, the color change unit is 108CCU/ml after 10 days of culture. Key words: Mycoplasma hyopneymoniae; medium; screening猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneymoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS，又称“喘气病”）的主要病原。猪肺炎支原体是一种微小的原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成呈点状露珠样菌落。但是由于生长速度慢，培养条件苛刻而难以培养1, 常因猪鼻支原体的过度生长
5、而被掩盖2。猪肺炎支原体的培养被认为是该病原体检测的黄金标准3。本实验将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM2培养基以及改良KM2培养基中进行了培养试验，采用颜色改变单位（CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，为快速、有效地诊断猪支原体肺炎提供参考依据。1材料及方法1.1材料1.1.1实验菌株 猪肺炎支原体168株，从南京天邦生物科技有限公司生产的猪支原体肺炎克隆弱毒活疫苗(支必宁)中分离。 猪肺炎支原体强毒济南株，由新疆畜牧科学院兽医研究所惠赠。1
6、.1.2培养基Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)、A26肉汤培养基(简称A26培养基)和驴血清培养基参考文献4配制；KM2培养基购于江苏农科院兽医所；改良KM2培养基由本实验室自己配制(1L：10g/L水解乳蛋白Hanks液400mL；DMEM400mL；无菌猪血清200mL；酵母浸液10mL；青霉素200IU/mL；酚红4g/L；pH调至7.6）。1.1.3试剂及仪器10Buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、2.5UTaq酶(北京诺维森生物科技有限公司)；Marker1、Loding Buffer(广东东盛生物科技有限公司)；PCR仪（T
7、C-512)，电泳仪等。1.2方法1.2.1菌株分离与复苏将冻存的支必宁和强毒济南株，在无菌条件下，分别用3mL灭菌水稀释，按10%的比例分别接入到5种液体培养基中进行菌株分离与复苏培养，每7天传代1次，共传23代。1.2.2颜色改变单位(CCU)计数将5种液体培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7mL，于第一管加入菌液0.3mL，混匀后吸取0.3mL至第二管，依次类推做10倍梯度稀释直到10-8，从最后一管中吸取0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照，每种培养基做两个平行组。于37恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，以培养基颜色改变的最末一管作为培养菌液的CCU。1.2.3 PCR方法
8、检测 参考文献5合成1对Mhp ldh 引物，上游引物p1为：5-CCGTTGAAGCCTTGCTGTAT-3，下游引物p2为：5-CGGTTAGTGTCTCCCGTTATG-3，扩增片段大小为287bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。模板提取：取各最后一管有颜色变化的培养基1mL，14000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL无菌TE缓冲液洗涤13次，之后用60100L TE悬浮，于沸水浴10 min，置冰上冷却后，10000 r/min 离心10 min，取上清作为模板。PCR体系（25L）：10Buffer 3L，10mM dNTPs 0.6L，上下引物各1L，模板4L，Ta
9、q酶0.3L，补ddH2O至25L。设定以下参数进行PCR反应：94预变性3min，94变性30S，54.6退火30S，72延伸40S，进行30个循环，72再延伸10min，4保存。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。2结果与分析2.1CCU计数结果表1 培养7天时各培养基CCU结果Table 1：The results of CCU in different medium after cultured for 7 days 培养基名称Medium name各稀释单位/Dilution unit10-110-210-310-410-510-610-710-8空白对照/Blank controlA2
10、6培养基/A26 medium驴血清培养基/Donkey Serum MediumGW培养基/GW mediumKM2培养基/KM2 medium改良KM2培养基/Improved KM2 medium注：“”表示有颜色变化；“”表示无颜色变化/Note: + the color change; - no color change表2 培养10天时各培养基变色情况Table 1：The results of CCU in different medium after cultured for 10 days 培养基名称Medium name各稀释单位/Dilution unit10-110-2
11、10-310-410-510-610-710-8空白对照/Blank controlA26培养基/A26 medium驴血清培养基/Donkey Serum MediumGW培养基/GW mediumKM2培养基/KM2 medium改良KM2培养基/Improved KM2 medium 注：“”表示有颜色变化；“”表示无颜色变化/Note: + the color change; - no color change各培养基两组平行管中的颜色变化情况基本一致，计数结果显示，猪肺炎支原体在改良KM2培养基中培养效果较好，培养基颜色改变最快，其次是KM2培养基。2.2PCR检测结果 于培养的第1
12、0天，用PCR方法对各种培养液CCU管进行病原体检测，结果如下图：图1 10天时各培养基CCU的PCR测定结果Fig 1:The test results of CCU between different medium by PCRM：DNA标准600；1：A26培养基（10-5/CCU）；2：驴血清培养基（10-5/CCU）；3：GW培养基（10-7/CCU）；4：KM2培养基（10-7/CCU）；5：改良KM2培养基（10-8/CCU）M:DNA Marker600;1:A26 medium(10-5/CCU);2:Donkey Serum Medium(10-5/CCU);3:GW me
13、dium(10-7/CCU);4:KM2 medium(10-7/CCU);5:Improved KM2 medium(10-8/CCU)结果显示10天时各培养基CCU管检测都出现了明显的目的条带，即说明当培养基有颜色变化时表示有猪肺炎支原体的生长。3讨论猪支原体肺炎之所以长期在世界各国广泛流行而得不到有效控制，原因之一是该病一旦在某地区或某猪场发生，慢性或隐性感染的猪症状不明显甚至没有症状，却长期带菌，成为传染源，进而传染给易感猪群。造成这一结果的根本原因，则是猪肺炎支原体很难分离培养，不易做出确诊6。培养的过程中，可观察到培养液的PH变化，大约在25天时，PH值降至6.8左右，以酚红作为指
14、示剂时，培养液由红色变为黄色，培养时间越长，PH下降越多，变色越明显，可作为观察有无支原体生长的一种既直观又简便的方法7，用CFU方法测定支原体含量较困难，而CCU计数法可比较直观的测定培养物中的活菌数，结果更具有代表性8，因此采用常规CCU法对液体培养基培养菌数进行测定，可以通过最后培养基的颜色变化单位来确定。有报道称，采用PCR方法不但能够达到和CCU计数相同的目的，还具有检测速度快、重复性强、效率高等优点，能特异地测定培养物中Mhp的核酸浓度从而确定其菌体数量，及时有效确定最佳收获时机，PCR 检测的最低限量约310-3g, 相当于1000个菌体左右9。而本试验采用PCR检测猪肺炎支原体在五种培养基中生长情况时，没有看到PCR方法有明显准确的计数效果，但是可以判断生长情况的好坏。因此，在计数效果方面CCU法明显优于PCR法，但在判断生长情况方面PCR法具有明显的优势。从培养基的成分分析，血清为主要营养的成分来源，从本研究可知添加猪血清的培养基较添加牛血清和驴血清的培养基更有利于猪肺炎支原体的生长，同时各材料的比例分配对培养效果也有一定的影响。目前实验室采用的牛心汤和Ha
