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1、 第一章 绪论根据生物学研究与应用技术可以划分为细胞工程 基因工程 发酵工程 酶工程 蛋白质工程基因工程定义：将来源于不同生物的DNA在体外经过酶切、连接，构成重组的DNA分子，然后转入受体细胞，使外源基因在受体细胞中得到表达的过程。细胞工程定义：指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，创建新的种质、改良品种、改进繁殖方法及大规模生产生物产品的技术酶工程定义：酶学原理与化工技术相结合而形成的应用技术领域，它是在一定的反应装置里，利用酶的催化作用，将相应的原料转化为有关物质的技术。 发酵工程定义：将微生物、生物化学和化学工程学的基本原理有机地
2、结合起来，利用微生物（工程菌）的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。 蛋白质工程定义：又称第二代基因工程，是利用基因工程等技术改良天然蛋白质的学科，它需要蛋白质化学、蛋白质结晶学、计算机辅助设计等学科的配合，通过对天然编码蛋白质的基因进行修饰，以获取比天然蛋白质更理想的新型蛋白质。 生物技术现状及展望美国：1999年政府投资高达180亿美元。 美国现有1300多家专业生物技术公司和15.3万多从业者，其生物技术产品销售额在1998年就达到了134亿美元，到2008年达到362亿美元。1996-2010年，生物技术为发展中和发达国家带来了同样的累积经济效益（均为390亿）在农业生物技术方
3、面：集中在大豆、玉米和棉花上。第一阶段：抗病虫和耐除草剂；第二阶段：提高作物的品质。比如：全球第一例转基因食品calgene公司的延熟番茄（1993）；抗玉米螟的转基因玉米，抗棉铃虫的棉花、耐除草剂的大豆等。在美国，经GM修饰或改造的作物或食品，1999年已达7000万英亩，目前大约有50大豆、33棉花、大量的玉米、少量的马铃薯、油菜和南瓜均是GM。中国：1986年启动“863”高技术规划的提出，农业生物技术列为优先发展项目。（植物组织培养技术，特别是茎尖脱毒快繁技术）1995年，掌握了转基因植物的全套技术，包括目标基因的分离、克隆、Ti质粒介导的表达载体的构建及目标基因表达的检测。由于基础研
4、究较弱，加上投资强度较低（35亿人民币/5年）,“七五”、“八五”、“863”计划中的相关部分的主市调只能是：跟踪、模仿和引进。展望1. 关于植物的繁殖（方式、速度等）； 2.关于动物的繁殖与性别控制（数量、性别）； 3.动物克隆：克隆绵羊Dolly（英国罗林斯研究所），克隆印度野牛（濒危物种 ）；4.生物反应器研究：美国开发了可生产人凝血酶原III的转基因羊；我国自行研制表达人凝血因子的转基因山羊（治疗血友病）；英国PPL制药公司也培育出可制造人胰蛋白酶抑制剂基因的克隆羊，在羊奶中能产生胰蛋白酶抑制剂，可用于治疗人类的哮喘病和肺气肿；荷兰制药公司制备了可大量生产人乳铁蛋白和促红细胞生成素（E
5、PO）的转基因牛。5.动物或人体器官的复制（用于器官移植）： 目前人造皮肤和人造耳朵已经成功，都是利用皮肤细胞进行培养得到的。人类角膜、心脏肺瓣、血管、耳、胰脏、肌肉、乳房组织替代物等工程化组织均已能在实验室里生长。植物生物技术的发展简史1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt的早期尝试。 在论文中描述了培养细胞的生长情况，但没有观察到细胞的分裂增值。1904年，Hanning进行幼胚培养获得小苗（萝卜，辣根）；1922年，Kotte和Robbins（Haberlandt的学生），培
6、养豌豆和玉米的茎尖培养，形成根和缺绿的叶片，可进行有限的生长（部分成功）；1933年，李继侗发现胚乳对胚培养的促进作用（银杏） ；1934年，Gautheret培养形成层，获得愈伤组织（山毛榉、黑杨）；同年，White培养番茄的根尖细胞，建立了第一个能够活跃分裂的单细胞无性系（28年，1600代），系统研究了光照、温度、pH、培养基组成对培养物的影响；1937年，White发明了第一个人工合成培养基；1937-1939年，愈伤组织的继代培养获得成功（胡萝卜，烟草）；1943年，White重新提出“植物细胞全能性”学说，出版了植物组织培养手册，标志着植物组培技术的建立，被誉为“植物组织培养之父”
7、；1948年，Skoog和崔澂发现腺嘌呤对烟草茎段培养物的芽的形成有诱导作用（腺嘌呤/IAA）；70年代以后，原生质体培养、原生质体融合的研究形成热潮80年代以后，基因克隆、遗传转化的研究更是如火如荼，在许多方面取得了令人瞩目的成果1973年，重组DNA技术诞生，植物基因工程始于20世纪80年代（Monsanto公司） 。Fraley1984年在Science 发表“利用农杆菌来转移外源DNA至白花丹叶烟草原生质体中”。表明：定向改造植物成为可能。在农林产业中的应用农业科学A、 良种繁育及脱毒苗木。B、种质资源的保存。C、育种上的应用。分子育种细胞育种 第二章 细胞工程原理细胞工程: 指在细胞
8、整体水平或细胞器水平上研究开发、利用各类细胞的工程，即人们根据科学设计，改变细胞的遗传基础，通过无菌操作、细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织培养和细胞培养等方法，改变细胞内的遗传物质以快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技术。细胞工程的研究内容:动、植物细胞与组织培养、细胞融合、染色体工程、胚胎工程、细胞遗传工程植物细胞工程：是指通过细胞培养、融合等细胞水平的操作，以及包含有多细胞的植物结构离体培养或操作，实现以细胞全能性为基础的改良种质或生产生物产品为目的的技术体系。植物活细胞的生命特征:新陈代谢 应激性 自体复制离体细胞的生命特征:培养细胞具备新陈代谢特性 、培养细胞具备应激性、
9、培养细胞可以展现自体复制特性培养基提供的营养物质包括碳水化合物、无机氮和有机氮、其他矿物营养、维生素等。水无机营养物（无机盐）碳源维生素生长调节物质有机附加物琼脂活性炭抗生素水：培养基中大部分是水它使细胞质呈胶体状态，活化状态也是细胞中各种生理、生化反应的介质起着维持细胞一定渗透压与膨压的作用并为植物机体提供氢、氧元素配制培养基时，一般用蒸馏水或去离子水，使水中少含或不含某些离子。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素是指氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、氯(Cl)和镁(Mg)。它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。微量元素是指铁(F
10、e)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、钴(Co)、钼(Mo)、铜(Cu)等，其需要量很少，大多为10-510-7mol/L，稍多则产生毒害。碳源：外植体光合作用的能力低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1-5(可维持的渗透压范围在-152至-415kPa蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3:1-3:2，约有1/4至2/5的蔗糖用于保持培养基的渗透压维生素类与植物体内各种酶的形成有关维生素类的种类很多，在植物组织培养中通常以
11、B族维生素为主使用浓度一般为0.1-1.0mg/L，其中以维生素盐酸硫胺素(Vit.B1)、盐酸吡哆素(Vit.B6)、烟酸（Vit. B3)、Vit.B12、泛酸钙(Vit.B5)、生物素(Vit.H)及维生素C最常用。肌醇(环己六醇)本身不促进外植体生长，但可能有助于活性物质发挥作用；培养基中的肌醇用量为50-100 mg/L。培养基中重要的有机氮源甘氨酸(Gly)、 丝氨酸(Ser)、 酪氨酸(Tyr)、 谷氨酰胺(Gln)、 天冬酰胺(Asn)等甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白
12、(LH)也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用生长素主要作用：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生常用：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)作用强弱顺序为：2,4-DNAAIBAIAA有不同的适宜浓度细胞分裂素：主要作用：促进细胞的分裂和器官分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。常用：激动素(KT)、6-苄基腺嘌吟(6-BA)、玉米素(
13、ZT)、2-异戊烯腺嘌呤(2-iP)、吡效隆(4PU，CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。强弱顺序为：TDZ4PUZT2-iP6-BAKT琼脂：琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢在植物细胞与组织培养中一直被作为首选固体培养基质而广泛应用用量一般在0.61.0当培养基pH值偏酸时，则琼脂用量要增加灭菌时间过长、温度过高均会影响其凝固活性炭：主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响可以防止酚类物质引起的组织褐化死亡，这在兰花组织培养中效果更明显活性炭使培养基变黑，有利于植物生根活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应既吸附有害物质，也
14、吸附有利物质，如植物生长调节物质、培养基成分降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固不宜过浓，以0.1-0.5为宜抗生素：主要目的：防止外植体内生菌造成的污染。 常用的抗生素：青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素和庆大霉素等，用量一般为520mg/L。大部分抗生素要求过滤灭菌。总体来说，在高等植物离体培养中，特别是在商业性快速繁殖中，应当尽量避免使用抗生素!培养细胞的分化与形态发生脱分化：是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。启动阶段：细胞质增生，并开始
15、向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现。 演变阶段：细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体。脱分化终结期：回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。 影响脱分化的因素：机械损伤、培养细胞的异质性、生长调节剂、光线再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程（现象）称为再分化。导管分化及其影响因素：离体条件下，导管分子由愈伤组织薄壁细胞分化形成，是愈伤组织细胞分化器官的前提。 生长调节剂。 生长素对维管组织分化过程有显著影响。 细胞分裂素对木质部分化的影响，主要表现在对生长素起协调和增效的作用。 生长素对维管组织分化所起的作用，很大程度下取决于糖的存在。低浓度生长素条件下，愈伤组织形成木质分子和韧皮分子的相对量，随蔗糖浓度变化而变化。细胞分化过程及其机理：极性：指植物的器官、组织，甚至单个细胞在不同轴向上存在某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。极性是植物细胞分化中的一个基本现象。导管分化的一个重要环节是细胞壁的
