《细胞凋亡的几种检测方法样本.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞凋亡的几种检测方法样本.doc（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细胞凋亡几种检测办法1、 形态学观测办法 （1）HE（苏木精 伊红染色法）染色、光镜观测：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观测：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此办法对反映细胞膜完整性，区别坏死细胞有一定协助。 （4）透射电镜观测：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜
2、皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增长，高分子DNA减少，胞质内浮现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律发生在核小体之间，浮现180200bpDNA片断，而坏死细胞DNA断裂点为无特性杂乱片断，运用此特性可以拟定群体细胞死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳浮现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时持续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞DNA断裂使细胞质内浮现核小体。核小体由组蛋白及其随着
3、DNA片断构成，可由ELISA法检测。 检测环节 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中具有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上组蛋白结合 4、加辣过氧化物酶标记抗DNA抗体使之与核小体上DNA结合 4、加酶底物，测光吸取制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精准测定凋亡细胞发生绝多对量。 3、 流式细胞仪定量分析 细胞发生凋亡时，其细胞膜通透性也增长，但是其限度介于正常细胞与坏死细胞之间。运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪测量细胞悬液中
4、细胞荧光强度来区别正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 应用价值 流式细胞仪检测具备如下特点： 1)、检测细胞数量大，因而其反映群体细胞凋亡状态比较精确 2)、可以做许多有关性分析 3)、结合被检测细胞DNA含量分析，可拟定凋亡细胞所处细胞周期 （1）检测形态学及细胞膜完整性Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜通透性液增长，但其限度介于正常细胞和坏死细胞之间，运用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，运用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区别正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 运用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞重要摄取Hoecha染料，呈现强
5、蓝色荧光，而坏死细胞重要摄取碘化丙啶（PI)而呈强红色荧光。 （2）DNA片断原位标记法 凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）构造保持不变状况下，用荧光素、地高辛或生物素标记脱氧尿三磷酸（DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反映与凋亡细胞裂解后3羟基（OH）端结合，经显色反映后检测DNA裂解点技术。 DNA片段原位标记法有二种： 1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT)技术，它是运用DNA多聚酶I将标记核苷酸连接到断裂DNA3OH端 2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL
6、)，即TUNEL法，它是运用TdT将标记DUPT接到3-OH端。研究证明，TUNEL法敏感性远高于ISNT，特别对初期凋亡检测，TUNEL更为适当。 （3）检测细胞膜成分变化Annexin V 联合PI法 原理：在细胞凋亡初期位于细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，它于PS具备高度结合力。因而，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测磷脂酰丝氨酸。故运用对PS有高度亲和力Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同步结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且
7、对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。 成果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。应用价值：细胞发生凋亡时，膜上PS外露早于DNA断裂发生，因而Annexin V联合PI染色法检测初期细胞凋亡较TUNEL法更为敏捷。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定导致细胞碎片过多及TUNEL法因固定浮现DNA片段丢失。因而，Annexin V联合PI法更加省时，成果更为可靠，是当前最为抱负检测细胞凋亡办法。办法及环节A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：(1
8、)收集1106个细胞，800rpm离心5min，4以上冷PBS洗一次。(2)用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。(3)用1ml含5% 人血清 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量荧光标记抗体(5105个细胞/20ul抗体)PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。(4)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：（1）收集2106个细胞
9、，用冷PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。（2）用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。（4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。（5）加入荧光标记（FITC）标记二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。（6）加入0.5ml
10、 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）制备：（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。（2）用4预冷70%冷乙醇固定，4保存 ，至少固定18小时。（3）调节细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37孵育30分钟即可进行流式分析。（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。培养细胞染色体显示法（1） 传代培养细胞染色体显示法培养细胞加秋水仙素采集分裂细胞离心低渗解决预固定固定重复固定制片染
11、色和封片1培养细胞：取处在指数生长期、用较大瓶皿培养、8090汇合单层培养细胞。 2加秋水仙素：使用最后浓度为0.020.8微克/毫升营养液，温箱继续培养610小时； 或用低温封闭法：把培养细胞置于4条件下612小时后，再于37温箱继续培养610小时解决（加秋水仙素）。 3采集分裂细胞：可运用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右重复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面重复冲刷。应用此法可使90中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观测。 4离心：收集培养液，1000转/分钟离心510分钟。 5低渗解决：吸除上清液、加入预温至370.075M K
12、Cl溶液，在温箱中静置2030分钟。 6预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此办法能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。 7固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂510ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置1520分钟。 8重复7，末次离心后，小心吸除大某些上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5 1ml。 9制片：用滴片法制片，按如下环节：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面浮现细微水气时
13、，及时向片一侧滴23滴细胞悬液，滴片时距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好标本可置盒中备用或及时进行染色观测。 10 染色和封片：普通惯用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观测。如标本需要保存或做长时间观测，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。（2）人末梢血微量全血培养染色体显示法1培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH 7.2），内含：1640培养液（含1015小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100单位和链霉素
14、100微克/毫升 培养液 2抽血针管准备：取25ml针管一支，在消毒后无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100 U/ml BBS）少量湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。 3采血：用棉签75酒精给患者或献血者皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血12ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.40.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两环节亦可在无菌条件略差环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血状况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。 4培养和加秋水仙素：37温箱中培养到6072小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最后浓度0.020.0
15、8微克/毫升营养液，再培养46小时。 5低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过0.075M KCl溶液10ml，置温箱中低渗解决1520分钟。6别的环节与解决传代细胞法相似。（3）羊水细胞培养1.抽取羊水：无菌抽取羊水10-20ml，及时注入无菌离心管2.离心分离：1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml.3.培养：加培养液4ml（含小牛血清1ml），用NaHCO3调PH至6.8，置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。4.别的环节与传代细胞染色体制备办法相似。普通染色体制片程序1、 取对数生长期细胞一种T75或T25瓶。2、 将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素培养基，解决12小时。3、 将细胞培养液倒掉，立即加入34ml 0.1%胰蛋白酶，并及时摇晃0.51min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，立即加入终结液终结消化，并将分裂相细胞收集在一种15ml离心管中，并在1200r/min离心4min。4、 将上清液倒掉，剩余50ul左右液在管中，并
