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1、北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02叶绿素荧光仪荧光测量原理 调制法叶绿素荧光 调制叶绿素荧光全称脉冲-振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）叶绿素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧光。调制叶绿素荧光仪的工作原理： 植物吸收的光能只有3条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1光合作用叶绿素荧光热。可以得出：叶绿素荧光1光合作用热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemical quenching, qP）；由热耗散引起的荧光淬灭称之
2、为非光化学淬灭（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。 用于激发荧光的测量光具有一定的调制频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”（避免环境光）测量走向了野外环境光下测量，由生理学走向了生态学。饱和脉冲法叶绿素荧光：饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PS II释放的电子越多，PQ处累积的
3、电子越多，光合电子传递被阻越多，荧光产量越高。当光化光达到使光合电子传递完全被阻（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1 s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。常用叶绿素荧光参数：经过充分暗适应后，所有电子传递链均处于开放态，打开测量光得到最小荧光Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为最大荧光Fm。根据Fm和Fo可以计算出PS II的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。 在光照下光合作用
4、进行时，只有部分电子传递链处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子传递链将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和F可以求出在当前的光照状态下PS II的实际量子产量Yield=PSII=F/Fm=(Fm-F)/Fm，它反映了植物目前的实际光合效率。 光照状态下打开饱和脉冲时，电子门被完全关闭，光合作用被暂时抑制，也就是说光化学淬灭被全部抑制，但此时荧光值还是比Fm低，也就是说还存在荧光淬灭，这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭。淬灭系数的计算公式为：qP=(Fm-Ft)/(Fm-Fo)；qN=(Fm-Fm)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm
5、-Fm)/Fm。 最初定义 qP和 qN时，认为只有可变荧光（FmFo）会发生荧光淬灭，最小荧光 Fo 不发生淬灭。但是，后来认为当 qN超过 0.4 时也会有明显的 Fo 淬灭。要正确计算 qP和 qN，就必须考虑 Fo 淬灭。此时qP=(Fm-Ft)/(Fm-Fo)；qN=(Fm-Fm)/(Fm-Fo)；当F达到稳态后关闭光化光，同时打开远红光（Far-red Light, FL）（约持续35 s），促进PS I迅速吸收累积在电子传递链中的电子，使电子传递链在很短的时间内回到开放态，F回到最小荧光Fo附近，此时得到的荧光为Fo。由于在野外测量Fo不方便，因此野外版的调制荧光仪（除PAM-2
6、100和WATER-PAM外）多数不配置远红光。此时可以直接利用Fo代替Fo来计算qP和qN，尽管得到的参数值有轻微差异，但qP和qN的变化趋势与利用Fo计算时是一致的。由于NPQ的计算不需Fo，近年来应用越来越广泛的。 根据PS II的实际量子产量F/Fm和光合有效辐射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）还可计算出光合电子传递的相对速率rETRYield PAR 0.5 0.84。单位是 mol 电子m-2s-1。上式满足如下假设： - Yield 代表全部光合量子产量 - PAR 代表入射到样品的光合有效辐射强度，单位为molm-2s-1-
7、传递一个电子需要吸收两个光子，因为光合电子传递需要两个光系统的参与（系数 0.5） - 入射光强有 84被叶片吸收（系数 0.84） 实际上，最后一个假设并不是永远都正确。尽管报道表明许多种植物叶子的吸光系数接近 0.84，但吸光系数还受许多其它因素的影响，如叶片的反射系数、叶绿素浓度和入射光的光谱组成等。在计算 ETR 时应考虑到这些因素的影响。下列是测定和计算的参数：参数测定单位由来PAR光合有效辐射molm-2S-1Temp温度Fs恒态荧光BitsFm光适应最大荧光BitsPSIIPSII量子效率No units（Fm-Fs）/FmqP光化学猝灭系数No units(Fm-Fs)/(Fm
8、-Fo)qNP非光化学猝灭系数No units(Fm- Fm)/(Fm-Fo Fm)NPQ非光化学猝灭系数另一种定义No units(Fm- Fm)/FmETR电子传递速率No unitsPAR*0.5PSII*0.84注意：有一些计算的参数入猝灭系数的数据不包含在PSII测定功能之内。因此可以进行非常有效的PSII的测定。同时计算无效的猝灭系数（需要参考暗反应下的测定Fo及Fm）。PSIIR功能：对强光的适应可以导致光合机构明显地变化，在能量到达作用中心前导致天线能量的非光化学耗散。不能正确解释这一效应就会导致对光化学和非光化学能量耗散相对贡献大小计算的误差。这一问题可以通过对样品瞬间遮光或
9、者用远红光优先激发PSI来解决。使电子冲电子传递链中传递出来，有效地开放PSII作用中心，能够测定光适应下的Fo，通常标记为Fo， PSIIR功能启动参数测定单位由来PAR光合有效辐射molm-2S-1Temp温度Fs恒态荧光BitsFm光适应最大荧光BitsFv光适应可变荧光BitsFv/Fm PSII天线效率No unitsPSIIRPSII量子效率No units（Fm-Fs）/FmqP光化学猝灭系数No units(Fm-Fs)/(Fm-Fo)qNP非光化学猝灭系数No units(Fm- Fm)/(Fm-Fo Fm)NPQ非光化学猝灭系数另一种定义No units(Fm- Fm)/F
10、mETR电子传递速率No unitsPAR*0.5PSII*0.84荧光探头介绍 作用光 传感器 远红光 饱和、调制光 显示屏 上键 下键 确认键 退出键 （探头反） （探头正）荧光测量介绍1、 在仪器的右下角插入TF小卡，此卡是用来储存荧光测量数据。2、 把荧光的探头插入到仪器右侧面相对应的插口内。3、 打开仪器主机，这个时候探头上的液晶屏启动（下图） 主菜单用户设定测量设定4、 主菜单中包含用户设定和测量设定，用上下键移动黑色光标可选择； 用户设定： 4-1时间设定：主要用于实时时间的设定，移动黑色光标按ENT键进入到时间设定后按上下键设定，设定完成按ENT键保存，按ESC退出。时间设置时
11、间：10:04:51日期：14-12-03 4-2光源设置：光源设置包含三种设置模式分别为：调制光束、作用光源、饱和光源； 黑色光标移动到调制光束按ENT键进入，设定频率中有1-5Hz五种设定由客户自行设定。光强设定中1-100%用户可以自行设定。设定完成按ESC退出。 黑色光标移动到作用光源设定按ENT键进入，光强设定中1-100%用户可以自行设定。设定完成按ESC退出。 黑色光标移动到饱和光源设定按ENT键进入，光强设定中1-100%用户可以自行设定。设定完成按ESC退出。4-3测量间隔设定：设定操作同上，Re为测量次数，最大可以自动测量10次。1-10之间用户可以自行设定。 T1为调制光
12、开启时间 T2为饱和脉冲光开启时间 T3为作用光开启时间 T4为饱和脉冲光开启时间 T5作用光开启时间 T6远红外光开启时间开始测量时调制光先开始启动重复闪烁T1时间后，饱和光开启T2时间后关闭，作用光开启T3时间，作用光关闭饱和光开启T4时间后关闭，作用光再开启T5时间，作用光关闭后远红外光开启T6时间。在开启饱和光和作用光同时，调制光一直闪烁。此时一组数据测量完成。T1T6的设定必须为采集时间的倍数。比如采集时间设定为30ms那么T1 T6的设定必须能整除30ms（即为采集时间的倍数）4-4采集间隔时间：采集间隔主要指仪器在测量一组数据的过程中每个数据保存的间隔时间。4-5文件名称设定：当
13、多个用户共同使用一台仪器时，用户可以设定自己的用户名来区别。测量设定：测量设定中包含两种测量模式，当进入到这个页面后黑色的光标移动的诱导测量或调制测量上时按ENT键开始测量。测量时液晶屏上显示为测量中，当测量完成后液晶屏显示测量数据，等待5秒后自动保存。保存后可以再数据浏览中直接看到上组测量的数据。测量模式选择诱导测量调制测量数据浏览 测量中Fo=0025Fm=0152Fo、=0350Fm、=0056 Fs=0124保存后数据测量完成。可以拿下TF卡直接读取数据。4-6本仪器保存的数据为EXEL格式。下面我们来讲解一下如何把EXEL中测量的数据来作图分析4-6-1这是我们得到的调制式荧光测量的
14、数据图4-6-2我们以样品号为001的一组为例，先选择第八行的数据点击复制（如下） 然后再新建个空白工作薄，选择B列，点击右键找到选择性粘贴（如下）点击选择性粘贴后选择“转置”然后点击确定的到下面的列表然后将样品号001中的剩下第9和第10刚用同样的方式粘贴到此表格中。当把所有数值导过来以后，然后再此表格的A列点一下，就是把要开始编辑A列了。A列的第一行写个1（就是标记这B列第一行的数值为序列1），然后把鼠标移动到A列第一行的黑色框的右下角，让其鼠标变为加号，点住鼠标直接拉到B列复制过来数的最后一组数的地方，会出现这个时候我们需要点击下这个图标，选择这个图标中的【以序列方式填充】点击一下就会呈现出下面的表格方式这个时候我们把A和B列全部选择选择完成后我们需要插入图表，点击插入选择里面的图表选择XY散点图中的无数据点平滑线散点图（就是我下图中的黑色部分）然后点击完成，这个就会得到我们需要的数据曲线图了。上述为调制式荧光测量的部分。下面我们来数下快速诱导式荧光部分任何建立曲线图。
