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1、 超声空化效应当声波通过液体时, 液体各处的声压会发生周期性的变化,相应地, 液体中的微泡核也会随超声频率发生周期性的振荡。在低声强下, 气泡的径向振荡受声压控制, 微气泡沿着平衡半径左右振荡多次, 在每一个振荡的微气泡周围将产生辐射压力和微束流。微束流能在气泡表面附近产生非常高的切变应激力, 使气泡变形甚至破裂, 可导致邻近的细胞或生物大分子受到影响, 产生一定的生物学效应。这种微泡随声压以其半径为平衡半径做周期性的振荡运动称为稳态空化。当作用声强增大, 使气泡的振荡幅度可与其平衡尺寸相比拟时, 气泡的振动即转而由其周围媒质的惯性所控制。空化核在超声场负压相半周期迅速膨胀, 而在正压相半周期
2、又急剧收缩至内爆, 这种空化称作瞬态空化或惯性空化。瞬态空化时气泡振荡十分猛烈, 最初气泡先是爆炸式地膨胀, 随后又迅速萎陷。在最后萎陷阶段, 会产生局部高温、高压现象( 泡内部的压力和温度可以达到几百上千个大气压和数千开) , 此外还伴随强大冲击波、高速微射流、自由基的产生1。这些极端的物理条件和化学基团的形成对正常细胞的结构和酶的生物活性有极大的破坏作用, 但同时对肿瘤细胞可进行有效的杀伤。与稳态空化相比, 瞬态空化除了微气泡发生剧烈的崩溃外, 另一个不同之处在于瞬态空化的产生须具有一定的阈值, 即当超声的声压达到一定值时, 才会引发瞬态空化过程。研究表明, 在瞬态空化下, 细胞和组织受到
3、生物学损伤的危险性较高。高强度的压力波会使细胞损伤、破裂、DNA 断裂, 以及血液溶血、组织损伤、出血等2- 3。在超声造影剂微泡加入的情况下, 空化核增多, 空化效应增强, 空化阈值降低。当然, 影响空化效应的因素很多, 如超声强度和超声频率、液体性质( 如温度、溶解的气体含量、表面张力、液体黏滞度) 等均会对空化效应产生影响。2.2 靶向作用超声造影剂能用于诊断和治疗, 除了利用超声的空化效应外, 在很大程度上还利用了超声造影剂微泡的被动靶向和主动靶向作用。微泡即使不加处理修饰, 也可利用其化学和电荷特性使之滞留于病变部位, 从而在一定程度上具有一定的靶向作用( 被动靶向) ; 若再加以不
4、同的方法处理修饰( 如在微泡表面连接能特异性识别病变部位或组织的细胞所表达的特异性抗原或受体的特异性抗体或配体, 或者利用亲和素- 生物素桥间接将微泡与靶细胞结合) , 造影剂可选择性地识别、结合靶细胞、靶组织或病变组织, 达到靶向显影诊断、给药治疗的目的( 主动靶向) 。3 超声及超声微泡的协同治疗应用3.1 介导基因治疗基因治疗是人类征服许多疑难疾病如遗传病、肿瘤、心血管疾病等的一种新的治疗手段, 人们对之寄予厚望。但目前进展缓慢, 在许多治疗方案中极少具有临床疗效。究其原因, 缺乏安全、高效的基因载体及基因转移方法是主要问题所在。近年来研究表明, 超声造影剂介导基因输送, 可明显地提高外
5、源基因的转染和表达, 有望成为一种高效、安全、操作简便的无创治疗手段。Lawrie 等4报道, 超声辐照可使裸露DNA 对血管内皮细胞的转染率提高10 倍, 可使质粒脂质体转染法的转染效率再提高3 倍。如在空化下使用微气泡与质粒结合, 则比单纯裸质粒的转染效率提高300 倍。如果空化下使用的微泡是脂质体微泡, 则基因转染效率将比单纯裸质粒基因的转染效率提高3 000 倍。Taniyama等5用编码荧光素的质粒DNA 体外转染人血管平滑肌细胞和血管内皮细胞, 24 h 后单纯质粒组细胞荧光素活性较低, 超声照射组比单纯质粒组高约70 倍, 造影剂+超声照射组比单纯质粒组高7 0008 000 倍
6、; 活体实验中, 质粒+造影剂+超声照射组比单纯质粒组细胞的荧光素活性高约1 000 倍。目前, 对于超声及超声造影剂能增强基因转染和表达的机制还不是很清楚。但大多数学者认为超声的空化效应一方面导致局部毛细血管和临近组织细胞膜的通透性增高, 细胞膜短暂地形成可逆性小孔; 另一方面微泡破裂时产生的冲击波、高速微射流和团快物质等加速基因进入细胞, 从而增强基因转染与表达6- 8。超声造影剂的加入大大增加了空化核的数量, 降低了空化阈值, 增强空化效应9。这一观点在一定程度上也得到一些实验研究的支持。Ward 等10使用淋巴细胞悬浮液, 引入造影剂且使其浓度可变, 加以超声, 观察到了2 种声孔,
7、即可修复性声孔和致死性声孔。冉海涛11等发现, 微泡造影剂联合超声辐照体外培养的血管平滑肌细胞膜上出现直径约12 mm、形态不规则的小孔; 有的小孔周边细胞膜局限性隆起, 呈弹坑样或火山口样; 少数细胞膜表面的孔洞直径较大可达58 mm; 并且发现细胞膜上出现的小孔是可逆的, 细胞能在24 h 内自行修复。另外, 在超声照射条件下外源基因表达增高的同时伴随着与细胞损伤修复有关基因的表达明显增高, 有学者认为后者表达增高上调了外源基因表达水平, 这也是超声波增强基因表达的主要机制之一12。当然, 影响基因转染和表达的因素很多, 如超声波的强度、频率、作用时间, 微泡的浓度、尺寸大小、性能和外源基
8、因的浓度、外源基因与微泡的比例、混合状态, 以及细胞的种类、物理状态等。Fischer13用不同的转染方法( 超声照射、LipofectAMINE2000或FuGene6 介导) 将pCAX- eGFP 质粒转染来自不同组织的神经元细胞, 发现细胞来源不同转染效率也不同, 并且同一来源的神经元细胞物理状态不同转染效率也不同: 在转染视网膜细胞时,超声介导转染的贴壁细胞数比LpofectAMINE2000 介导的大, 与FuGene6 介导的相当; 在超声介导情况下, 贴壁细胞的转染细胞数比悬浮细胞的转染细胞数增加了近3 倍; 然而, 在转染PC12细胞时, 超声介导的悬浮细胞的转染率要高于贴壁
9、细胞, LpofectAMINE2000介导的转染率要高于超声介导的转染率。3.2 药物输送原理同基因治疗类似。同口服药物治疗相比, 用超声破坏携带药物的微泡的治疗方法可以实现在特定组织靶向释放药物,达到减少全身药物用量、提高局部药物浓度、增强药物疗效的目的, 还可以避免药物受到外部环境的破坏、延缓药物的释放、保持药物原有的代谢性质及降低外源性药物引起的毒副作用和免疫反应等。由于脂类造影剂具有天然的靶向功能, 生物相容性好、稳定性高、使用安全, 被广泛用于药物输送。如目前在美国和欧洲上市的包载抗癌药物阿霉素与道诺霉素的就是由脂质体构成的膜材料。当然, 就微泡成膜材料而言, 高分子材料韧性高、抗
10、压性能突出、显影时间长, 在携带基因或药物治疗中也具有极大的发展潜力。另外, 纳米级微泡由于能在尽可能低的背景噪声下明显增强回声信号从而强化突出靶区病灶; 以及因其纳米级的小尺寸而具有极强的穿透力, 可穿过血管内皮细胞间隙实现血管外的靶向诊断与治疗等特性, 也具有巨大的发展潜力。当然, 目前超声联合造影剂作为一种安全、有效、操作简单和具有一定靶向的无创性的基因治疗和药物输送手段还处于探索阶段, 还有许多问题尚待解决: 基因或药物与载体微泡的结合方式问题。结合方式会影响基因和药物的靶向传输和结合效率。不同的结合方式各有优势, 探索一种既能有效地包载基因或药物、又能方便微泡靶向结合靶向细胞并高效释
11、放基因或药物的结合方式无疑具有重要意义。Frenkei14将荧光素酶质粒DNA整合入白蛋白微泡中, 采用一定超声参数照射转染培养的293细胞, 发现微泡包载DNA 对细胞的转染率比DNA 与微泡混合黏附的转染率高5.1 倍。Unger 等15用大豆油悬浮亲水性的药物紫杉醇, 再用磷脂包裹经声振成平均直径为2.9 m 的微泡, 在2.5 kHz 超声作用下显影良好并能够释放包裹的药物。安全性, 这是超声基因治疗或药物输送中的关键性问题。如果辐射剂量不当, 超声空化和造影剂在增强基因转染和药物输送效率的同时也会损伤细胞、DNA 和人体组织。Dalecki16等曾报道, 微泡造影剂与超声的联合作用有
12、时会引起心腔内溶血。Guzman 等17发现, 诊断用超声照射微泡造影剂在血液中引起溶血反应, 在单层细胞培养基中引起细胞膜的破坏、坏死和脱落。靶向性问题, 即如何将基因或药物准确地富集于目标靶组织。虽然微泡本身具有一定的被动靶向作用, 但由于携带基因或药物的微泡在血液循环中很容易被血流冲击而自微泡上分离或者被血液中的DNA 酶清除、破坏和降解, 也由于微泡自身不能长时间保留在血液循环中等原因, 因而只靠被动靶向作用很难把基因或药物输送到靶组织。为此, 必须采用主动靶向实现释放外源基因或药物。血管内膜屏障问题。对于血管外病变部位, 由于微泡造影剂很难穿透内皮细胞间隙进入血管外介质, 因而血管内
13、膜屏障是阻碍实现血管外基因或药物治疗的一个重要因素。转染效率的最优化问题。不同的研究者采用的超声仪器设备、参数、作用方式、基因或药物与微泡的结合方式及实验对象均不一样, 这些都会影响基因转染和表达效率。因而优化条件缺乏系统性, 优化参数未形成共识。3.3 溶栓治疗血栓形成和血栓栓塞是许多心脑血管疾病如急性心梗、中风等的病理机制。治疗心脑血管疾病的关键是血栓和栓塞的准确诊断及血栓的软化、溶解。目前临床上治疗血栓的方法有静脉注射大量溶栓剂、血管内超声消融和体表治疗性超声助融等。静脉注射大量溶栓剂容易引起出血等并发症, 因而具有较大的局限性。血管内超声消融也存在有创、操作复杂、不能用于治疗极细小的血
14、管栓塞、易发生血管壁损伤和远端小血管栓塞等缺点。研究发现, 将溶栓药物与微泡结合再连接能识别纤维素或血凝块成分的配体, 则可实现靶向结合血栓。若再在体表加以一定条件的超声作用, 利用空化效应破坏微泡, 可加速血栓软化、溶解。这比超声与药物联合应用或单独使用药物溶栓效果更好、更快,并且能减少所需的溶栓药剂量, 从而减轻或避免其不良反应。Luo 等18研究表明, 微泡超声造影剂能加速体内尿激酶等向血栓内渗透, 从而增强治疗性超声的溶栓作用。Nishioka 等19研究表明, DDFP 微泡超声造影剂能够增强超声的空化效应, 有明显的溶栓功效。Porter 等20的体外实验证实, PESDA 联合纤
15、维蛋白溶解因子, 可使血栓溶解率显著高于单独超声照射或尿激酶, 而PESDA 联合尿激酶和超声的血栓溶解率则更高。金玉等21在体外实验中将尿激酶结合在MRX- 408 微泡的外壳上, 当微泡与血栓结合后, 用超声波照射引起微泡破裂, 释放出药物, 从而使血栓软化、溶解。超声造影剂助栓、溶栓作用是利用空化效应使血栓表面产生机械损伤, 从而增加溶栓药物与血栓的结合位点, 达到加速血栓溶解的目的22- 23。应用超声联合造影剂微泡治疗血栓须重点解决的问题是微泡靶向结合血栓的方法。一种是利用亲和素- 生物素桥的方法,把抗纤维素单克隆抗体生物素、亲和素连接在合适的微泡上, 通过亲和素- 生物素桥将微泡结
16、合到纤维蛋白上24。另一种方法是利用血小板糖蛋白Gpb /a 受体在激活的血栓上高密度、高水平表达并促进血小板聚集和血栓形成的特点, 在微泡表面结合一种具有能识别Gpb /a 受体的活性结合部位的六氨基肽, 可实现靶向结合血栓25。Unger 等26在体外试验中发现, 含有能靶向结合活化的血小板GPb /a 受体的寡肽的磷脂包裹全氟代丁烷微泡造影剂MRX- 408, 与Gpb /a 结合后可牢固结合到血栓, 表明二者的亲和力极高。3.4 炎症靶向显影当组织因为各种原因发生炎症时, 常表现为血管内皮细胞表面某些标志物发生异常。如生长因子受体及整合素家族的出现是肿瘤滋养血管生成的内皮标记物; 早期动脉粥样硬化形成区内皮细胞上ICAM- 1( 内皮细胞黏附分子) 过度表达; 炎症情况下, 活化的内皮细胞可迅速表达P- 选择素、E- 选择素等
