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1、枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子pglva整合表达载体的构建及启动子功能的初步探讨 华中农业大学 硕士学位论文 枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子PglvA整合表达载体的构建及启动 子功能的初步探讨 姓名：余志强 申请学位级别：硕士 专业：发酵工程 指导教师：梁运祥;樊俊华 20040601 华中农业大学2004届硕士毕业论文 摘要 在原核生物界，枯草芽孢杆菌 Bacillus 发展前景的外源基因表达体系。但枯草芽孢杆菌自身没有合适的内源质粒，现 用于枯草杆菌的载体大都来自于其它种属的细菌，如金黄色葡萄球菌，乳酸杆 菌等，虽然已有外源基因成功克隆表达的报道，但由于其在枯草杆菌中存在分 离复制的不稳定及外源基因的
2、克隆表达效率低的现象，故都不是枯草杆菌的最 佳选择。 将外源目的基因整合到染色体上复制表达是解决染色体外复制质粒在宿主 中遗传不稳定现象的有效策略。另外，一个好的表达载体除了遗传与复制稳定 外，还应该有一个高效的表达盒。包括启动子元件，终止子元件和合适的多克 隆位点。其中，一个强而可控的启动子是实现外源基因高效表达的关键。启动 子表达的强弱一般会受到自身和宿主多种因素的影响。 element 本课题主要工作是构建带有代谢物阻遏元素 eatabolite repression 载体PAX01为骨架的整合表达载体Pyzq3： 另外，为了初步探讨枯草杆菌sp00A因子对麦芽糖启动子的功能，从枯草卡T
3、 菌acillus II Ecoli 质粒pBluescript ne07 抗性基因为枯草杆菌中的筛选标记，构建了基于枯草杆菌sp00A基因 位点的整合载体Pyzq1。 培养基中含l浓度的葡萄糖的情况下由PAglvA控制的B一半乳糖甙酶酶活。 结果表明，启动子PAglvA在O5浓度的麦芽糖诱导下表现出最大的活性； 培养基中存在l的葡萄糖，由启动子PaglvA控制的B半乳糖甙酶的活性受 华中农业大学2004届硕士毕业论文 到抑制；spoOA基因产物的缺失 印。删。 ，由启动予PAglvA控制的B一半乳糖甙 而且，在培养基中存在I葡萄糖及spoOA基因产物的 酶的活性也受到抑制； 缺失却。删 双重
4、因子的作用下，启动子PglvA的活性受到了严重且长久的抑 制。 同源重组 关键词：桔草芽孢杆菌；麦芽糖启动子；spoOA基因； 4 华中农业大学2004届硕士毕业论文 Abs仃act TheBacillus to the best-characterized on subtilis，next Ecoli，is prokaryotic organism the and levelButtheBacillus subtilisdoes notcontain genetic，biochemical physiological vectorsfor are Bacillus now subtilis
5、takenfrom endogenousplasmidsThe proper plasmid other as aureus or bacterium，such lactococcuslactisandsoon genus Staphlococcus successfulhasbeen is nowclearthatthese arefar Although cloning reported，it plasmids from forBacillus oflow effieienciesof and levelsof subtilis，because optimal higb cloning instability replicating ofcloned into the chromosomeisa usedtoavoid Integration genes strategy genetic efficient cassette is addition，a fora instabilityIn expression necessary optimal expression in vectorBacillus the and subtilis，besides replicating genetic stabilityTheoptimal cassette includesthe
