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1、限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系buffer及与其它酶双切的buffer等、酶切反应温度有些酶是在50、55或30等温度下反应的、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基 ，同尾酶、同裂酶 1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题 纯度差或残留酶切抑制物最为常见 。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制
2、物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换 。【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过
3、多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗.）d. 吸取酶时的tips。我们常用来取酶的t
4、ips都是最小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是最常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的 tips，专门去酶液用。1.3 buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分连接酶的buffer更是这样，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时
5、就会出现问题。1.4 双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度具体可以参考各厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见http:/www.neb- 酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的质粒，质粒就会因大肠杆菌的Dam,Dcm被甲基化；如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA就会因CG methylase的影响而被甲基化。一些酶切位点被甲基化后，酶切会受影响。因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。甲基化通常出现在
6、特定序列，以Xba I为例，仅当序列位5-【TCTAGA】TC-3时，Xba I的位点才会被甲基化，并非所有的Xba I位点都会出现甲基化。具体的列表可以参考http:/ Enzyme MethylationSequence &Site Methylation Type Enzyme Activity Blocked?AarI 5.CACCTG cG.3 C partiallyApaI 5.GGGCC cG.3 C partiallyApaI 5.GGGCCc WGG.3 D partiallyBclI 5-TGaTCA.3 A CompletelyBglI 5.GCC(N)5GG cG.3
7、C partiallyBglI 5.GCc WGGNNGGC.3 D CompletelyEsp3I 5.CGTCTC.3 E CompletelyHincII 5.GTYRA cG.3 C partiallyHinfI 5.GANT cG.3 C partiallyHpaII 5.CCGG.3 E CompletelyHphI 5.GGTGa TC.3 B CompletelyMboI 5.GaTC.3 A CompletelyNheI 5.GCTAG cG.3 C partiallyNmuCI 5.GTCA cG.3 C partiallyNotI 5.GCGGCCGC.3 E Compl
8、etelyPvuI 5.CGATCG.3 E CompletelyRsaI 5.GTA cG.3 C partiallySalI 5.GTCGAC.3 E CompletelySatI 5.G cG GC.3 C CompletelySmaI 5.CCCGGG.3 E CompletelyXbaI 5.TCTAGa TC.3 B CompletelyXhoI 5.CTCGAG.3 E partiallyType A: a - N6-methyladenine (m6A)Type B: a - N6-methyladenine (m6A), Partially Overlap Dam Methy
9、lase Site GATCType C: c - 5-methylcytosine (m5C)，Overlap CGType D: c - 5-methylcytosine (m5C) ，Partially Overlap Dcm Methylase Site CCWGGType E: m5CG or m5CNG（这种修饰主要发生在植物和动物来源的DNA）1.6 酶切体系问题：通常较大的反应体系（=50ul），较少量的质粒(=1ug,或更少)，酶切的会更加完全一些。1.7 酶切或双酶切时，保护性碱基及近末端位点碱基个数的问题。在酶切PCR产物时，酶切位点旁的碱基个数可能会影响酶切效率。同样，
10、在双酶切载体时，如果两个载体相邻过近，也有可能会影响酶切效果。这个问题以前也曾有讨论，具体可以参考http:/ . 1&age=0#8577107欢迎战友多多讨论。关于相关的资料可以参见：http:/www.neb- 针对PCR产物酶切位点保护性碱基的资料http:/www.neb- 针对载体酶切位点近末端位点碱基个数对酶切影响的资料2. 质粒酶切时出现smear。2.1 体系中的内切酶含量过高：通常酶切体系中的内切酶含量不宜超过酶切体系的10，不管是单一酶切还是双酶切，酶的含量在5一下是比较合适的。由于酶是保存在50甘油缓冲液中，过高的酶用量会导致甘油含量提高，而从引起酶的星活性；2.2 酶
11、切反应过程中有导致星活性的因素：有些内切酶除了对甘油浓度外，对离子浓度、反应温度、酶含量、反应时间等都可能产生星活性。所以在使用内切酶时，一定要留意说明书中的描述，避免可能出现星活性情况的发生。减少酶用量、合适的反应温度、不进行长时间的酶切反应，可减少星活性的出现。2.3 酶切体系可能污染了其它物质：如其它的DNA、其它的内切酶或DNA酶等。 感谢amberly战友的支持和提议, 尤其感谢wht5945战友对“内切酶热失活温度”、“星号活性”以及“酶切位点保护碱基”等内容的补充与整理。wht5945战友的帖子除了补充和整理外，还具有独立参考的价值。他的宝帖见：限制性内切酶的热失活：http:/
12、 . 1&ppg=1#8893410内切酶星号活性：http:/ . 1&ppg=1#8893487限制性内切酶保护碱基：http:/ . 1&ppg=1#8893511进37度之前，用vortex或移液枪混一下是否更好一些，能把壁上的液体旋掉!但注意枪头不要尽量沾带上溶液，减少体系损失！限制性内切酶的热失活热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度是37的酶在65下温育20分钟即可失活。一些在65下不能失活的酶如将温度升高至80，温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。在50l的反应体系中，37条件下，以0.5g小牛胸腺DNA作为底物，加入5-10l内切酶及相应缓
13、冲液，反应60分钟，然后升温至65或 80温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5g底物DNA（通常为DNA），调节温度至最适反应温度，温育60分钟。若琼脂糖电泳显示底物部分或完全被消化，则表明该酶没有完全被热失活。下面附上一些酶热失活的温度表内切酶星号活性在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（10）。Polisky等（4）对EcoR I的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等（11）的研究表明，只要识别中心的四碱基序
