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1、 香港生科仪有限公司 BiosciEquip Supply International Co.，Limited 一、ELISA方法的及步骤：ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一)原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，
2、每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二)操作步骤 方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2.加样：加一定稀释
3、的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分钟。 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410n
4、m)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml， 每孔加0.1ml，4过夜。次日洗涤3次。 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔 中,置37孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml， 37孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 (三)试剂器材 1.试剂 (1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO1.59克 N
5、aHCO 2.93克 加蒸馏水至1000ml (2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO12H2O2.9克 NaCl8.0克 KCl0.2克 Tween-200.050.5ml 加蒸馏水至1000ml (3)稀释液： 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成510使用。 (4)终止液(2MHSO）： 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98)21.7ml。 (5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 0.2M NaHPO(28.4克L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克L) 24
6、.3ml 加蒸馏水50ml。 (6)TMB(四甲基联苯胺)使用液: TMB(10mg5ml无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75HO 32l (7)ABTS使用液: ABTS0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3HO 2l (8)抗原、抗体和酶标记抗体。 (9)正常人血清和阳性对照血清。 2.器材: (1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50l及100l加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 (2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 (3)4冰箱，37孵育箱。 (四)注意事项 1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验
7、条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: (1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 （2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.09.6
8、之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用41824小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10gml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110gml。 (3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 (4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色
9、。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。 生物谷网站 http:/ 二、ELISA原理与分类ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固
10、相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2.ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应
11、的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：2.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中
12、抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值
13、（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测
14、中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不
