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1、实验二 微生物的分离与活菌计数一.实验目的 掌握倒平板的方法 几种常用分离纯化微生物的基本操作技术 学习平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理（一）微生物的分离与纯化的概念从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程（二）分离纯化微生物的常用方法1.简易单细胞挑取法 单细胞挑取法可以直接得到纯培养。它需要特制的显微操纵器来分离单细胞，或直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。2. 平板分离法 （1）选择适合于目标微生物生长的培养基 （2）设计获取单菌落的有效方法 （3）纯培养的确认 （三）活菌计数将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接
2、种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（四）方法比较1. 涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！2. 混合平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！三.实验器材1.材料：土壤2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3.仪器或其他用具：无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱四.实验步骤（一）采样 取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 冰箱中暂存。（二）倒平板（无菌操作）培养基加热溶化，待冷至55-60 倒入培养基于无菌培养皿中 （三）制备土壤
3、稀释液（无菌操作）1.制备土壤悬液 5g土 45ml无菌水 振摇约20min,使土壤与水充分混匀2.梯度稀释 1ml土壤悬液 9ml无菌水 以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液 （四）平板分离单菌落（无菌操作）稀释涂布平板 平板划线 （五）活菌计数（涂布梯度 (10-2、10-3、10-4、10-5)）1：采用平板培养计数法要求操作熟练准确，否则难以得到正确的结果;2：样品充分混匀；3：每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；4：同一稀释度三个以上重复,取平均值；5：每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；（六）培养平板倒置，恒温培养细菌培养37，1-2d 放线
4、菌培养28，5-7d 霉菌培养28，3-5d （七）确认与计数1.确认多次的分离与纯化过程和多种特征鉴定 2.计数肉眼计数或用菌落计数仪五.作业1用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何特点？答：一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别在遗传学实验或菌种鉴定工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。优点：操作简易方便，菌落分离纯化的效果良好。2试比较浇注平板法和涂布
5、平板法的优点和应用范围。答：浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可以用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离，而涂布平板法则更适合于好氧性或有气生菌丝的放线菌和细菌的分离。3实验结果及分析。涂布平板法：用10-2浓度的菌液进行平板涂布，涂布平板法所得的结果为：由于涂布不均匀，形成了大量菌苔，不能计数。其他浓度计数组数梯度10-510-410-31226702171503114110平均数1315.7110随着梯度浓度从10-3，10-4，10-5的降低，单菌落也呈减少趋势，但在其中由于实验操作不当也会引起误差。六实验注意事项1划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板2 平板倒的不能太薄，琼脂含量应该高些，否则会因平板太软而划破3 作涂布用的平板，到平板式培养基不宜太烫，否则易在平板表面形成冷凝水，导致菌落扩展或蔓延。若将凝固平板先倒置，搁在皿盖上并留一开口，事先放在37恒温箱中一段 时间，则可保证平板表面无冷凝水形成。4 平板划线和涂布平板时都在无菌的环境下进行。
