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1、叱格列酮抗LPS模型小鼠抑郁表型的作用及其机制研究第一部分吡格列酮抗抑郁作用的代谢组学研究及氧化应激验证目的 : 探讨LPS诱导小鼠抑郁模型中的病理生理学改变，并且通过结合行为学实验、代谢轮 廓分析及氧化应激相关指标检测，揭示PPAR-y激动剂PIO抗抑郁作用的可能机 制。方法:48只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,20-25g)单笼饲养于室温222C,12h 昼夜节律 (早上 8点开灯 ), 自由摄食水。在适应性喂养一周、基线行为学测定(OFT,FST以及SPT)后，小鼠被随机分为三组:(1)LPS 组，接受 LPS(1 N L/只,i.c.v.)、NS(20 mL/kg,i.g.) 处
2、理;(2)LPS+PIO 组，接受 LPS(1 N L/只,i.c.v.)、PIO(20mL/kg,i.g.) 处理;(3)对照组，接受 NS(1n L/只,i.c.v.) 、NS(20 mL/kg,i.g.) 处理。LPS(血清型 0127:B8) 和PIO分别以10ng/ nL和1 mg/mL的浓度溶于NS在LPS或NS侧脑室注射的2h前实行PIO或NS的灌胃处理。术后即刻称量 体重，并且进行术后24h内的SPT,随后进行24h后的OFT以及FST当行为学实验(n=14/ 组 )结束后 ,立即处死小鼠、 取出脑组织、 分离海马用于进一步的代谢轮廓分析(n=10只/组)、WB佥测(n=4只/
3、组)。每组中2只小鼠接 受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用GC-MSJ术进行三组中小鼠海马组织的代谢轮廓分析。运用多元统计分析，包括PCA PLS-DA和OPLS-DA4行差异代谢物的鉴定。止匕外，采用7次循环交互验证和200次响应排序的RPTXtOPLS-DA真型进行 考察。OPLS-DA变量的重要性用 VIP法评价。运用IPA进行差异代谢物的相关分析，基于Ingenuity Knowledge Base数据库中的信息 , 鉴定最具代表性的经典通路和分子互作网络。根据代谢轮廓分析的 结果，采用W明析进行小鼠海马内氧化应激相关指标的进一步验证结果:1.PIO对接受中枢炎性应激小鼠行为
4、学改变的影响：中枢LPStt射诱导 小鼠抑郁样行为，包括快感缺失、行为绝望(表现为SPT中糖水偏好的下降、FST 中不动时间的延长)；同时伴有焦虑样行为(表现为OFT中中心活动距离的下降) 以及急性病样反应，包括探索性活动、自主活动的降低(表现为OFT中直立次数、 总活动距离的下降)，这些改变被PIO预处理不同程度地逆转。然而，作为急性病 样反应中负能量平衡的结果,PIO 预处理未能改变体重的降低。总之，这些结果表明PIO预处理可逆转侧脑室LPS注射诱导的小鼠抑郁样、焦虑样行为以及某些急性病样反应。2.基于GC-MS勺小鼠海马代谢轮廓分析：(1)在 TIC 色谱图中的色谱峰代表相应的代谢物 ,
5、 并且通过峰面积归一化法确定他们的相对浓度。本研究中 , 三组海马组织代表性 TIC 色谱图的分析信号强 , 峰容量大 ,R.T. 重现性好。每组中初步检测到 229 个代谢物 , 这些代谢物对应的浓度被用于后续的多元统计分析。在PCA身分图中，R2X>0.5,表明三组之间可明显区分(R2X=0.609,Q2=0.213)。在PLS-DA得分图中，这三个比较集中也有明显的区分， 包括 LPS与对照组之间(R2X=0.421,R2Y=0.997,Q2=0.874),LPS+PIO 与 LPS组 之间(R2X=0.233,R2Y=0.959,Q2=0.564),以及 LPS+PIOt对照组之
6、间 (R2X=0.397,R2Y=0.989,Q2=0.938)。止匕外，用于差异最大化的OPLS-DA真型显示三个比较集中的显著区分，包括LPS与对照组之间(R2X=0.421,R2Y=0.997,Q2=0.864),LPS+PIO 与 LPS组之间 (R2X=0.233,R2Y=0.959,Q2=0.627),以及 LPS+PIOt对照组之间(R2X=0.397,R2Y=0.989,Q2=0.936)。由于 PLS-DA OPLS-D前的关键参数 Q2 均 >0.5, 说明模型稳健、有良好的拟合度和预测性。RPTt用来评估OPLS-DAK型，其中原始的R2,Q2值显著高于对应的置换
7、值，并且所有的Q2均<0,说明OPLS-DA真型稳健、没有过度拟合(分别为 R2=0.708,Q2=- 0.492;R2=0.786,Q2= - 0.293;R2=0.6,Q2= - 0.471)。(2) 通过 OPLS-DA1型中 VIP>1 以及 Bonferroni-或 Dunnett-校正的 P值<0.05, 三个比较集中总共鉴定出 52 个差异代谢物。他们主要参与氨基酸、能量和核苷酸( 嘌呤、嘧啶) 代谢。在这52 个代谢物中，从三个比较集中分别鉴定出41,15和35个差异代谢物(LPS与对照组之 间;LPS+PIO与LPS组之间;LPS+PIO与对照组之间),它们
8、被认为分别与炎症相关 抑郁症的发生、 PIO 的作用 , 以及上述两个因素之间的相互作用潜在相关。运用 IPA 分析出三个比较集中的五大最受影响经典通路及改变最显著的互作网络。 此外 , 基于这些代谢物的生化联系 , 整合包含最多差异代谢物的通路、 构 建出整体概要图 , 该概要图提示包含多数差异代谢物的神经传递、能量代谢、氧化应激过程可能参与炎症相关抑郁症的发病机制及PIO 的抗抑郁作用。3.小鼠海马内氧化应激相关指标的检测：除神经传递外，GSH代谢通路是 LPS+PICffl与LPS组比较中干扰最显著的通路；止匕外,IPA互作网络分析预测与抗 氧化过程有关的SOD MP3能与PIC的作用有
9、关。在本研究中，相比于对照组,LPS 组中发现氧化应激的活化，表现为促氧化的NCXHI基gp91phox,p47phox的上调， 抗氧化的SCD1 GPX1的下调。然而，相比于LPS组，这种失衡在LPS+PIO组中被不同程度逆转，与代谢的结 果一致。这些结果提示PIO预处理有效缓解中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁模型中 促氧化 / 抗氧化状态的失衡。结论:本研究证实了 PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑行为，以及 某些急性病样反应中的有益作用。基于GC-MS勺三组问代谢轮廓分析发现了氨基 酸代谢 , 能量代谢以及核苷酸代谢的扰动, 提示相关的神经传递、 能量代谢、 氧化应激的扰动可能(至少部
10、分)参与炎症相关抑郁症的发病机制,并且PPAR-丫激动 剂可能通过对这些过程的扰动产生抗抑郁作用。此外,WB验证进一步明确了氧化应激的改变。 本研究为炎症相关抑郁症的发 病机制,以及PPAR-丫激动剂在其中发挥抗抑郁作用的分子机制提供新见解 ,同 时可能为伴随免疫活化的抑郁症患者的治疗提供新靶点。第二部分叱格列酮抗抑郁作用的相关信号通路蛋白检测目的：应用PPAR-丫激动剂PIO与拮抗剂GW9662M/T PPAR-丫活化在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁 样行为中的有益作用 , 进行相关信号通路蛋白检测 , 进一步探索其作用机制。方法:45只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,18-22g)单笼饲养
11、于室温222 C,12h昼 夜节律 ( 早上 8 点开灯 ), 自由摄食水。在基线时，进行OFT FST,随后经过5天的适应期，期间训练小鼠适应盛清水 的双饮水瓶存在，随后进行SPT)需要注意的是，与实验I相比，提前进行OFT亍 FST,以避免由于术前、术后检测时间问隔短而造成的潜在影响。在基线行为学评估后 , 将小鼠随机分为 4 组 :(1) 对照组(NS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(2)LPS组(LPS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(3)LPS+PIO 组(LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;NS,i.p.);(4)LPS+PIO+GW9662
12、 组(LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;GW9662,i.p.)LPS(血清型 0127:B8),PIO 和 GW9662tb别以10 ng/仙L,1mg/mL和2 mg/mL的浓度溶于NS,并且体积分别为1 L/只,20 mL/kg,1 mL/kg 。在脑立体定位手术前2h和30min分别给予PIO（或NS）和GW966绒NS收t理。 随后，小鼠接受LSP（或NS）中枢注射。术后的操作流程, 包括体重测量、 行为学检测、 样本采集同实验I（n=9-10） 。每组中 2 只小鼠接受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用W眼术进行小鼠海马内相关彳S号通路及蛋白的检测，包括JAK2/ST
13、AT3 通路、CREB/BDNF路及其下游效应分子，以及5-HT1AR（n=6）。2果:1.PPAR-y 活化对中枢炎性应激诱导的小鼠行为学改变的影响 ：如实验I,侧脑室LPS注射诱 导小鼠出现快感缺失、 行为绝望 - 抑郁症的核心症状; 以及焦虑样行为和急性病样反应，包括体重下降，探索性活动、自主活动的降低（LPS组vs.对照组）。除了体重下降之外，PIO可不同程度地逆转这些表型改变（LPS+PIO组vs.LPS组）,PIO 的这种改善作用被 GW9662a断（LPS+PIO+GW9662 vs.LPS+PIO组;LPS+PIO+GW9662 vs.对照组）。PIO、GW9662勺预处理对中
14、枢LPS注射诱导 的体重下降无影响。总之，这些结果显示PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑样行为及 某些急性病样反应中发挥PPAR-丫依赖性的有益作用。2、小鼠海马内相关信号 通路及蛋白检测：（1）为了检测PIO是否通过激活PPAR-丫，经特定的信号通路发 挥抗抑郁作用，我们检测了小鼠海马内PPAR-y的水平,以及与炎症诱导抑郁样 行为有关的蛋白激酶，包括JAK2,STAT3的表达。中枢LPS刺激后出现PPAR-丫的显著降低（LPS组vs.对照组），这种降低被 PIO预处理逆转（LPS+PIO组vs.LPS组），该PIO效应被GW9662H断（LPS+PIO+GW9662vs.LPS+P
15、IO组,LPS+PIO+GW96韶 vs.对照组）。（2）中枢 LPS 刺激后，促炎细胞因子IL-6表达升高，其下游JAK2/STAT3言号通路活化，表现为 磷酸化 JAK2/总 JAK2（p-JAK2/t-JAK2）,p-STAT3/t-STAT3 的比值上调。有趣的是,PIO预处理抑制了这些改变，而这种抑制效应被GW9662&断。（3） 作为炎症状态下JAK2/STAT31路重要的下游效应分子，我们发现中枢LPS刺激后 出现的IDO1表达增高被PIO预处理显著逆转，该逆转效应被GW9662a断。（4）接受LPS注射的小鼠脑中5-HT1AR表达显著低于又1照组小鼠。PIO预处理逆转5-HT1
16、AR的下调（LPS+PIO组vs.LPS组），但未能使其恢复至正常水平 （LPS+PIO组vs.对照组）,GW9662阻断PIO的该种效应。作为可被炎症诱导、介导5-HT 前体色氨酸沿犬尿氨酸通路降解的限速酶 ,IDO1 的活化引起色氨酸分解代谢的增加 , 可很好地解释抑郁症中 5-HT 合成的降低，以及中枢5-HT能神经传递的障碍。此外,5-HT1AR可通过结合5-HT参与中 枢 5-HT 能神经传递。我们关于IDO1、5-HT1AR的发现提供了一种可能性：PPAR-丫的活化可能对中 枢5-HT能神经传递产生潜在影响，这种效应也可能参与PIO在该模型中的有益作 用。（5）本研究中，我们还检测了神经营养相关 CREB/BDNF路，以及下游的突触 可
