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1、一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用Primer Premier5搜索引物打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”
2、，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp.点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需
3、要着重查看的包括：Tm应该在5570度之间，GC应该在4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物
4、搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（
5、Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3端的Delta G.3端
6、的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3端和整个引
7、物的二聚体图示和Delta G值。Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC需要控制在4060，而且上下游引物之间的GC 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、GC method和2(AT)4(GC)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，
8、Tm 值可以控制在5070度之间。第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Del
9、ta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择FilePrint，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。二、引物设计过程中的心得1、
10、Primer 5.0搜索引物Primer Length我常设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是4060。其它参数默认就可以了。搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端2个A或T,或引物
11、内部连续的G或C太多，或引物3端2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。2、Oligo 6.0评估引物在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65的时候，The most stabl
12、e Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。Hairpin Formation根据黄金法则False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。在PCR栏，设计者感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。G参照黄金法则，这其实很好
13、理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以G绝对值越大结构越稳定。3、其他两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50的退火温度肯定和65对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。我们感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外
14、，不是112那么确定。错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。自从1985年美国PECetus公司的人类遗传研究室 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PCP0 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之- I。然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗
15、传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的， 目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标
16、准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。引物的长度一般为15-30 bp，最好在1824 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量21。引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。引物序列的GC 含量最好在40一60，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5端向 3端递减，3端AG最好不要高
