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1、实验一 荧光物质稀溶液的激发、发射和同步荧光光谱测定一. 实验目的1.学习荧光分析法的基本原理和LS55B发光分析仪的操作。2.学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。二. 实验原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。 在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫
2、外光照射强度及所选测量波长等因素有关。苯酚由于其共轭结构，有荧光活性，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。对于复杂组分，当激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象时，可以用同步荧光扫描，同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。三. 实验仪器和试剂1. LS-55型发光谱仪;2. 移液枪(德国BRAND公司生产);3. 50ml容量瓶，25ml容量瓶10支;4. 苯酚储备液：960mg/L5. 去离子水;四、实验内容1.预扫描(pre-scan) 用储备液配制浓度为10ppm（mol/L）的工作液，设定仪器参数，进行全波长预扫描，并记录扫描结果，得出最大激发和发
3、射波长，同时查看其瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2激发光谱、发射光谱和同步荧光扫描设定合适的参数，分别对苯酚溶液进行荧光激发、发射和同步荧光光谱扫描。取浓度为0.010（mol/L）的工作液，扫描发射光谱，加水稀释后再在同样波长下扫描发射光谱，观察荧光猝灭效应。发射光谱参数：扫描波长范围200750nm；Ex=214nm、270nm，扫描速度=1000 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,，记住取文件名。激发光谱参数：扫描波长范围200-750nm，=300nm、586nm，扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,
4、记录信息。同步荧光光谱：扫描波长范围250-750nm, (-)=30nm、86nm,扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录信息。3三维荧光光谱扫描设定发射波长范围，激发开始波长，步长，测定数目，开始进行苯酚三维荧光光谱扫描。五数据处理1用实验获得的数据绘制苯酚的激发、发射、同步光谱。2对比不同浓度下的苯酚的最大激发波长和最大发射波长处的峰高，了解荧光猝灭效应。取浓度为0.01（mol/L）的苯酚溶液，固定激发光的波长为270nm，狭缝宽度为10.0nm，发射光的狭缝宽度为5.0nm，扫描波长范围250750nm，扫速为1000nm/min，
5、扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下： 图7将溶液稀释后再以同样的条件扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下：图8从图7与图8（图8中红色线是稀释前的曲线，蓝色线是稀释后的曲线）上可明显看出稀释后的峰的强度大了许多，这是由于在高浓度时一部分苯酚的发射光被自身吸收了，发生了荧光的猝灭，而浓度低时这种自身吸就大大减少，峰的强度反而变大。所以，荧光分析的浓度不能高。3. 用MATLAB绘制三维荧光光谱。4. 由实验的到荧光的光谱如下：（1）荧光激发、发射、同步的光谱如下： 410nm处出现的峰为瑞利散射峰，在测发射光谱时将波长范围定在410nm以内；测的最大发射处波长波长约为2
6、70nm，瑞利散射处波长为410nm，所以同步荧光波长范围设为350490； （2） 浓度改变及光强改变后的光谱：浓度减小后最大发射波长不变，但强度相应减小。相应的狭缝减小对应的光强减小。 （3） 固体荧光的检测： 由图知该纸张的荧光效应不是很强，荧光增白剂相对较少。六讨论与思考1对待测溶液进行预扫描的有何作用？找出带测样品的最适宜激发波长，观察有无瑞利散射峰干扰。2 观察激发光波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现倍频峰。不适合于进行定量分析。3同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。同步扫描有助于一些有机化合物的判别，特别是一些复杂的混合物。同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响。同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱，峰较窄。在合适的扫描波长差值下，同时扫描激发光谱和发射光谱重叠波长处，才同时产生信号。4比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。 紫外分光光度是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的光谱分析法。荧光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象。和前者相比，荧光灵敏度高；发光参数多；分析线性范围比吸收光谱法宽；选择性更好；能分析的体系有限，应用范围不如前者。后者必须具有大的共轭键结构。
