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1、小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1. 主要仪器设备(1) 倒置显微镜（Olympus，Japan）(2) CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3) 100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4) 6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5) Eppendroff管(6) 1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7) 离心机(8) 5ml冻存管(9) 两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2. 主要试剂配制(1) MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液低糖
2、DMEM母液1) 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2) 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。4) 搅拌直至完全溶解。5) 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。6) 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4保存(1个月内用完)。MEF培养液取100ml上述配
3、好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56，30min灭活过），4保存至使用。(2) PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl4.0gKCl0.1gNa2HPO4.12HO21.445gKH2PO40.1g于121高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4冰箱中保存备用。(3) 0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液在100
4、ml超纯水中分别溶解胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799)0.25gEDTA0.02gNaCl0.7gNa2HPO4.12HO20.024gKH2PO40.024gKCl0.037gTris0.3gD-葡萄糖0.1g酚红1mg于4过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在1030下冻存备用。(4) 0.1%的明胶水溶液称明胶0.1g （Sigma, G9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121高压灭菌45min，于4保存。(5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液1) 0.5mg/ml的丝裂霉素
5、C母液在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4避光保存。2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37的CO2培养箱中预温30min.。(6) 冻存液取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。3.
6、 动物：性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。二、实验步骤1. 获取小鼠胚胎(1) 将8周龄的昆白鼠和12周龄的昆白按1:1比例合笼。(2) 次日晨10:00前观察鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。(3) 实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。(4) 75酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。(5) 用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。(6) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。
7、(7) 将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。(8) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。(9) 将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。(10) 将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。(11) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块培养法）(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块（需剪约200
8、下）。(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。(5) 再加入1 mlMEF培养液终止消化，室温下静置5min。(6) 吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。(7) 每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。(8) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培
9、养瓶放入37，5CO2，100RH的培养箱中培养。(9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。3. 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养：(1) 用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。(2) 每瓶用滴管加入约3ml的PBS，轻轻前后晃动培养瓶，洗涤细胞一遍，吸弃PBS。(3) 每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液，能盖住培养瓶底，室温下静置作用30秒，吸弃消化液
10、。(4) 在倒置镜下观察，当细胞变圆时即可加入45mll MEF培养液终止消化，并用滴管吸培养液用力吹打整个瓶底（约30下）。(5) 将培养物全部吸置尖底离心管内，静置5min，将上层细胞悬液吸置另一离心管内。(6) 1000r/min（80-1离心机为80g）离心5min，吸弃上清液。(7) 每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。(8) 每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞（吹打时勿产生气泡）。(9) 将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察，可见细胞呈大小不一的圆形。(10) 将装有消化后细胞的培养瓶放入37，5CO2，100RH的培养箱中培养
11、。(11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3消化传代（操作同前，省略步骤5中的静置和换管）。4. 饲养层制备(1) 明胶预包被培养板：取1个6孔培养板（COSTAR ,每孔直径为3.5cm），先紫外照射30min，每孔用5ml刻度滴管加入3ml的 0.1%明胶水溶液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃明胶水溶液，并用2ml的PBS洗涤一遍。(2) 丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。(3) 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预
12、温的PBS洗涤细胞5次，每次3ml（加样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁，勿直接冲冲击底壁的细胞）。(4) 消化：每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化液，室温下作用10秒，立即吸弃消化液，加入3mlMEF培养液终止消化，并吹打壁底细胞（应注意逐瓶操作，避免消化时间过长而使细胞丢失过多）。(5) 离心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内，1000r/min离 心5min，弃上清，得细胞沉淀块，往一个离心管的沉淀块内加入3ml的MEF培养液混悬细胞，再吸至另一离心管中混悬沉淀块。(6) 计数并调整密度：吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然
13、后将细胞悬液吸至一培养瓶或血清瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞密度为3105个/ml。(7) 接种：每孔加3 ml密度为3105个/ml的细胞悬液（因为培养孔的直径为3.5cm，故其底面积S=r2=3.141.752=9.42 cm2，根据接种的细胞数为1105个/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3105个/ml的细胞悬液）。(8) 培养：将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37、5%CO2、RH（相对湿度）100%的培养箱中培养。5. 饲养层细胞的冻存和复苏实验(1) 冻存1) 细胞：镜检，将处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞用于冻存实验。弃旧培养液，后以PBS或新鲜培养液漂洗
14、细胞一次。2) 消化：常规0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化制备单细胞悬液。3) 离心重悬：80g离心10min，弃上清，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。4) 冻存：细胞逐级降温冷冻：40C冰箱40min-200C冰箱40min-800C冰箱保存备用。(2) 复苏培养1) 冻融：从低温冰箱中取出冻存细胞，置于370C水浴锅内，不时振摇冻存管，使细胞快速融化。2) 洗涤：转移冻存管内细胞于离心管中，80g离心5min，弃上清，沉淀用含新鲜DMEM（低糖型）重新悬浮，制备单细胞悬液。3) 接种：接种细胞于培养瓶中，置370C、CO2培养箱内进行过夜培养，1224小时后，更换培养基，按照细胞的生长状况进行相应处理。1
