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1、重组人白介素一2注射液Chongzu Ren Baijiesu-2 ZhusheyeRecombinant Human Interleukin-2 Injection本品系由高效表达人白介素-2的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜 稳定剂，不含防腐剂和抗生素。1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合现行版中国药典三部“凡 例”的有关要求。2 制造2.1工程菌菌种2.1.1名称及来源 重组人白介素-2工程菌株系由带有人白介素-2基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。2.1.2种子批建立、传代及保存应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3菌种检
2、定 主种子批与工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1划种LB琼脂平板应呈典型的大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2 染色镜检应为典型的革兰氏阴性杆菌。2.1.3.3对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。2.1.3.4电镜检查（工作种子批可以免做） 应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反应 应符合大肠杆菌生物学性状。2.1.3.6 人白介素-2表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。2.1.3.7质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准
3、序列相符。2.2 原液2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发 酵罐接种用。2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3 种子液接种及发酵培养2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的 发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查 （附录IX G）。2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集处理菌体。2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。2.2.6 高度
4、纯化 经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1 项要求，即为人白介素 -2 原液。加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。2.2.7 原液检定 按 3.1 项进行。23 半成品2.3.1 配制与除菌2.3.1.1 稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。2.3.1.2 稀释与除菌将检定合格加稳定剂的人白介素-2 原液用 2.3.1.1 项稀释液稀释至所需浓度。除菌过 滤后即为半成品，保存于28C。232 半成品检定按 32 项进行。24 成品241 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。242 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
5、2.4.3 规格 应为经批准的规格。244 包装应符合“生物制品包装规程”规定。3检定3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录X D）。3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录W B第二法）。3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0X107IU。3.1.4 纯度3.1.4.1 电泳法依法测定（附录W C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%, 加样量应不低于10p g （考马斯亮蓝R250染色法）或5pg （银染法）。经扫描仪扫描，纯度应 不低于 95.0%。3.1.4.2 高效液相色谱法依法测定（附录III B）。色谱柱以
6、适合分离分子质量为5-60kD蛋白质的色谱用凝胶为 填充剂;流动相为O.1mol/L磷酸盐一O.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0及适宜的表面活性剂 上样量不低于20p g,于波长280nm处检测，以人白介素-2色谱峰计算理论板数应不低于 1000;按面积归一化法计算，人白介素-2 主峰面积应不低于总面积的 95.0%。3.1.5 分子量依法测定（附录W C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%， 加样量应不低于1.0 g,分子质量应为15.5kD1.655kD。3.1.6外源性DNA残留量每1支应不咼于10ng （附录IX B）o3.1.7 宿主菌蛋白残留量应不高于
7、总蛋白质的0.10% （附录X C）。3.1.8 残余抗生素活性依法测定（附录X A），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS， 应将 SDS 浓度至少稀释至 0.01%。3.1.9 细菌内毒素检查每1支应小于10EU （附录XII E凝胶限量试验）。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至 少稀释至 0.0025%。3.1.10等电点主区带应为6.57.5，供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致。（附录W D）。3.1.11紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100p g/ml500p g/ml，在光路1cm、波长 230nm360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为2
8、773nm （附录II A）。3.1.12肽图（至少每半年测定一次）依法测定（附录哪E），应与对照品图形一致。3.1.13 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次）用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：（Met）-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。3.2 半成品检定3.2.1细菌内毒素检查每1次人用剂量每100万IU应小于10EU, 100万IU/支以上规格的，每支应小于10EU （附录XII E凝胶限量试验）。如制品中含有SDS,应将SDS浓度至少稀释至0.0025%。3.2.2 无菌检查依法检查（附录X
9、H A）,应符合规定。3.3 成品检定3.3.1 鉴别试验按免疫印迹法（附录哪A）或免疫斑点法（附录哪B）测定，应为阳性。3.3.2 物理检查3.3.2.1 外观应为无色或微黄色澄明液体。3.3.2.2 可见异物依法检查（附录V B）,应符合规定。3.3.2.3 装量依法检查（附录V F）,应符合规定。3.3.3 化学检定3.3.3.1 pH 值应为3.54.5 （附录V A）。3.3.3.2渗透压摩尔浓度依法测定（附录V H）,应符合批准的要求。3.3.4 生物学活性应为标示量的80%150% （附录X D）。3.3.5残余抗生素活性依法测定（附录IX A）,不应有残余氨苄西林或其他抗生素活
10、性。如制品中含有SDS, 应将SDS浓度至少稀释至0.01%。3.3.65无菌检查依法检查（附录XX A）,应符合规定。3.3.76细菌内毒素检查每1支应小于10EU （附录XII E凝胶限量试验）。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀 释至0.0025%。3.3.87异常毒性试验依法检查（附录XII F小鼠试验法），应符合规定。3.3.98残余乙腈含量如工艺中采用乙腈，则照气相色谱法（附录III C）进行，色谱柱采用石英毛细管柱， 柱温45C，汽化室温度150C，检测器温度300C，载气为氮气，流速为每分钟4.0ml，用 水稀释乙腈标准溶液使其浓度为0.0004%，分别吸取1.0ml上述标准溶液及供试品溶液顶空 进样400“ l,通过比较标准溶液和供试品溶液的峰面积判定供试品溶液乙腈含量。乙腈含 量不高于 0.0004%。3.3.109 SDS含量 （待定）4. 保存、运输及有效期于28C避光处保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。5. 使用说明应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
