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1、细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:25min6.羊血清封闭：度，分钟.一抗，度过夜，一般要大于小时或者度小时.度PBS洗净，min次.二抗度小于一小时.度PBS洗净，min凉干封片（封闭液.） 活细胞免疫荧光技术流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)用10FCSRP
2、MI1640调整细胞浓度为51010ml取40l细胞悬液加入预先有特异性McAb(550l)的小玻璃管或塑料离心管，再加50l 120(用DPBS稀释)灭活正常兔血清4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm5min弃上清，加入50l工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇4 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm5min加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500l固定液)FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存57天)（二）试剂和器材1.各种特异性单克隆抗
3、体。2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项1.整个操作在4下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。附:1. DPBS (10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000ml
4、NaHPO 11.5g 临用时用蒸馏水110稀释KHPO 2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5)4NaN?50ml (终浓度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2)甲醛10mlNaN0.2g (终浓度0.02)4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项1.整个操作在4下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。4.细胞活
5、性要好，否则易发生非特异性荧光染色。附:1. DPBS (10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNaHPO 11.5g 临用时用蒸馏水110稀释KHPO 2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5)4NaN?50ml (终浓度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2)甲醛10mlNaN0.2g (终浓度0.02) 严重同意楼上的讲解。我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。我想请问楼上：NaN哪里有
6、卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？ 我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95100时，从孵箱中取出。2、用预温的1PBS洗3次，每次10分钟3、4的甲醛室温固定2030分钟4、1PBS洗3次，每次10分钟5、0.2Triton X100透化25分钟6、1PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1BSA稀释）30分钟，闭光！11、1PBS洗3次，每次10分钟12、95甘油封片注：4%甲醛，0.2%T
7、riton，5%BSA均用1PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。2. 4冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。3. 0.2Triton X100通透10分钟，PBS洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。5. 一抗4度湿
8、盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 我要做的是occlu
9、din，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适 各位同仁:我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。请高手指教。万分感谢！能发一个邮件更好，再一次感谢！我的E-mail： 抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间 bu不是原创 我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少） 顶一下 我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理？ 我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法，找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。 不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定
