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1、附件1： 四川农业大学大学生科研兴趣培养计划项目申报书项目名称 四川玉米主要叶斑病菌的群落遗传结构 项目负责人 黄 明 洋 学 院 农 学 院 联系电话 18980173627 申报日期 2009年 12月24日 四川农业大学制表项目名称四川玉米主要叶斑病菌的群落遗传结构起止时间2009 年 12 月至 2010 年12 月负责人姓名年级所在学院、专业联系电话E-mail黄明洋08-1农学院植保（药）项目组成员刘萍08-2农学院植保（药）李倩08-1农学院植保（药）导 师姓名张敏职务/职称教授博导通讯地址4-203电话13608266875E-一、 立项依据（项目意义、现状分析等）玉米是粮食、
2、饲料和工业原料兼用农作物，是我国的第二大粮食作物。2007年，玉米播种面积、总产和单产分别达到44216.3万亩、15230万吨和344.5公斤/亩，分别比2003年增加8114万亩、3647万吨和23.7公斤/亩。玉米快速发展为我国粮食连年增产做出重要贡献，2003-2007年，玉米总产增加对全国粮食增产贡献率达到44%以上，位居各大粮食作物之首2008年，在金融危机影响下，玉米消费也同样受需求弱化的冲击。中国的惠农政策于危难中挽救国内市场，在国内玉米连续五年增产以及经济形势不利的重压之下，玉米价格仍能逆风而上。中国政府明确强调在当前国际金融危机状况下，要大力发展农业生产，加强农产品扶持力度
3、。在当前金融危机及能源匮乏的社会大环境之下，玉米加工必将成为拉动内需，促进经济发展的利器。随着中国经济实力的增强，居民消费水平不断提高，人民对农副产品的需求，尤其是蛋油肉鱼的需求与日俱增，作为主要的饲料原料玉米的消费也将上升。随着畜牧业的稳步发展和玉米加工业的不断壮大，饲料消费稳步增长，工业消费迅猛发展，国内玉米消费将继续刚性增长。四川是粮食生产大省，常年粮食总产量保持在3000万3500万t之间，居全国第3位，是全国13个粮食主产区之一，也是西部地区唯一的粮食主产省。同时，四川也是人口大省和粮食转化大省。种植业是四川农民传统的主要收入来源，而种粮收入占种植业收入的70%以上。水稻、小麦、玉米
4、、红苕等四大粮食作物在四川粮食生产中占有突出地位。据文献资料，19952005年的11年间，四川玉米的平均纯收益在74.3元/666.7，低于水稻。近几年四川省玉米生产“高成本高产出、低成本低产出”的特征非常明显，作为四大主要粮食作物之一的玉米在产量上应进一步提高，其中最主要的是应大力推广高产抗病良种和实用增产技术，减轻病虫害损失，提高玉米的单产水平。玉米叶斑病严重危害植株，使叶片布满病斑，甚至干枯，对产量影响很大。大斑病于1899年首先在我国东北报道，但危害不大。20世纪70年代自从引进单杂交种、双杂交种后及栽培制度的变化，病害发生逐渐普遍，并逐年威尔还加重。东北、西北春玉米栽培区、华北夏玉
5、米栽培区及南方高海拔山区尤为严重，成为玉米生产上最严重的病害之一。该病害引起的损失主要是果穗的减少，种子干瘪，千粒重减轻。损失程度于病情和病菌侵染时期有关，在玉米授粉后23周受害，损失可达50%，尽管授粉45周后受害，可减产15%25%，接近成熟时尽管发病严重，但影响不明显。小斑病在我国早有发生，据估计一般中等发病年份感病品种损失约10%20%，严重时可达30%80%，甚至毁种绝收。二、 项目方案（具体方案、实施计划、可行性分析） (一)具体方案技术路线图采样组织分离纯培养得出结论1.1采样1.1.1采样地点成都，射洪，达州，南充，郫县，广元，内江，绵阳，三台，筠连，宜宾，雅安，渠县，武胜，西
6、昌，资阳，峨边，德阳，营山，资中邻水 （广安市）、大竹 (达州市)、南充 、仪陇 （南充市）、广元 丹巴 （甘孜州）、筠连（宜宾市）、屏山 （宜宾市）、雷波 （凉山州）、叙永 （泸州市）、汉源（雅安市）112采样方法在各采集地点按品种、症状表现采集15-20个样本，样本为玉米发病叶（不需考虑叶片为第几片叶）2.1菌种的分离采用组织分离的方法进行菌种分离：1、 从各地采回的样本中分别挑选具有代表性的叶片，从病斑切取每边约5毫米的小块病组织，用70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中处理3-5分钟；而后用灭菌水换洗三次，将其移置在马铃薯蔗糖琼胶培养基（PD）平板上培养。2、 液体平板静
7、置培养法 挑取适量菌丝体移入装有马铃薯蔗糖液体培养基的培养皿中，装液量为培养皿容量三分之一，接种菌丝体悬浮于液体培养基表面，25培养34d；当病菌在液体培养基上形成菌落，用灭菌牙签挑取菌落，无菌水冲洗一次，吸去多余水分，将菌体（菌丝和孢子）收集于离心管中，用冷冻干燥机-110冻干23d，研磨成粉，备用。3.1菌种的纯培养菌种经组织分离得到单一菌株后分别接种到马铃薯蔗糖琼胶培养基（PD）平板上培养。培养皿需注明菌种和种类，采集时间，采集地点4.1病菌的接种4.1.1实验田的化分4.1.2接种液制备待培养基上扩繁的病菌长出分生孢子时，取出培养基并用灭菌水冲洗，制成孢子悬浮液，（孢子悬浮液的配制可用
8、清水或2%的蔗糖溶液，）孢子浓度1*1051*106个ml，滴加0.1%吐温振荡摇匀即可用于接种。413接种待幼苗长至810叶期时，进行喷雾接种。接种后保湿24h，然后室温进行正常管理，室内温度控制在25左右。接种两周后进行发病调查。玉米大、小叶斑病的接种一般采用苗期接种方法：选择产生孢子的和致病性较强的菌株，在培养基上繁殖，洗下孢子配成悬浮液。病叶采回保湿，促使孢子产生，也可用来接种。孢子悬浮液的配制可用清水或2%的蔗糖溶液，接种时将孢子悬浮液喷在幼苗上，保湿12-16小时，一般是在接种后7-14天记载。4.2.1致病性的测定采用感染指数法测定致病性。感染指数=100我们可以用感染指数法分级
9、玉米大、小斑病的致病能力。如下表2表2 玉米大、小病病株的分级病级发病程度代表数值株数0.5轻微侵染，只有下部叶片有1-2个病斑0*1.0轻微侵染，下部叶片有少量分散的病斑1*2.0轻度侵染，下部叶片有中等数量的病斑2*3.0中等侵染，下部叶片病斑很多，中部叶片也有少量病斑3*4.0重度侵染，下部和中部叶片病斑很多，发展到上部叶片4*5.0极度侵染，所有叶片上都有大量病斑，病株可能在成熟前枯死5*4.3.1鉴别寄主采用化分级数的方法表示寄主的抗性表2 玉米的抗性级别级别抗性症状0级不发病0E级不发病 但也可能是避病1级抗病 只有最下面叶片有少数分散的病斑2级抗病 最下面叶片轻度发病，下面第二叶
10、片上有分散的病斑3级抗病 下面叶片第三叶片轻度发病，最下面叶片发病中等或较重4级中抗 下面叶片中度到轻度发病，扩展到中点，中点下叶片轻度发病或只有分散的病斑5级中感 下面叶片严重发病，中点下叶片轻度或中度发病，中点以上叶片不发病6级中感 植株下面1/3部分严重发病，中点叶片中度发病，中点以上叶片 有零星病斑7级感病 中点和中点下叶片严重发病，上面病害扩展到剑叶下面的叶片，或剑叶也有少量侵染8级感病 中叶和中叶下叶片严重发病，植株上部1/3部分中度或严重发病，剑叶发病显著9级高感 所有叶片都严重发病，穗状花序也有一定程度发病4.3.2刬分生理小种5.1基因指纹图谱分析5.1.1病菌DNA提取采用
11、CTAB法提取病菌DNA，溶于适量TE后，于-下保存。5.2.1RAPD反应及电泳供试引物、dNTP和Tap酶均由公司生产。DNA Marker DL2000为Takara公司生产。根据次重复PCR的试验结果、扩增产物特异带有无和重复等标准，筛选出扩增效果较好的引物。PCR反应总体积为l,反应体系中含PCR缓冲液（500mmol/L Tris-HCL,25mmol/LMgCL2）2.5，dNTP1(2.5mmol/L),Tap酶0.5(2U/),引物2(4mol),DNA模板（ng/）,ddH2O 18。PCR反应程序：预变性9410min；扩增94 20s，37 3s ,72 80s,，共个
12、循环；延伸min。程序结束后取出扩增产物在.%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为，电压为/cm。电泳结束后，在紫外凝胶成像系统上观察，保存图像。5.3.1数据统计分析 每条RAPD带均看作一个遗传位点，根据某一DNA片段在样品中出现赋值“1”和不出现赋值“0”组成“1，0”资料表。根据NTMAS中的Jaccard公式计算各菌株间的遗传相似系数（Gs），应用平均距离法（UPGMA）进行聚类分析，对0，1数据数量化处理，通过NYSYS version 2.1程序运算建立聚类图。5.4.1结论与讨论通过相似性系数、遗传距离的聚类图分析，能够比较出各菌株间的遗传亲缘关系，同时按不同的相似率划分出不同的基因组
13、。若要明确病菌的生理小种，可根据菌株在DNA水平上的差异结果，同时利用传统的鉴别寄主的致病性测定来实现。6.1菌种的保存菌种的保存可采用燕麦片玉胶培养基（配方见附表2）保存或矿物油下保存（二）实施计划：2009年12月-2010年2月资料查阅、整理，实验设计和实验材料的前期准备；2010年2月-2010年8月玉米主要叶斑病菌的群落鉴定、分离以及对其遗传结构的分析；2010年8月-2010年9月整理实验结果，撰写论文，并投稿。（三）可行性分析：1、玉米品种、实验设备学校可以提供2、实验技术可由本组研究生和指导老师提供指导3、由于实验为期一年，时间虽紧，但我们相信能按时完成三、预期研究成果（如鉴定、学术论文、获奖、申请专利、推广应用等）研究成果：1.保存具有代表性的病叶样本及菌株样本2、确定四川玉米叶斑病菌群体遗传结构3、针对其遗传结构研究控制方法4. 在全国统一刊号的学术期刊如种子、玉米上发表12篇学术论文。四、经费预算（如材料费、资料费、版面费、专利费等）科 目申请经费/（元）备注（计算依据与说明）（1）差旅费3000到四川各地采样的车费及食宿费（2）出版物/文献/信息传播费1000争取在各类期刊发表1-2篇科技论文（3）实验用品和材料2000实验所需的材料及资料打印费等（4）试验地使用费（3）本文来源于子午学术论坛(http:/www.ziwu.org/bbs)
