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1、湖南农业大学课程论文学 院： 班 级：姓 名： 学 号：课程论文题目：分子标记技术在农业中的应用课程名称：分子生物学评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期： 年 月 日分子标记技术在农业中的应用学生：刘结卯（动科院09级畜牧班 学号：200940511227）摘要：自20世纪80年代以来，随着分子生物学技术在各个领域的发展，产生了另一类重要的遗传标记，即以直接检测DNA分子碱基序列变异=为基础的分子标记。植物在长期进化过程中产生的可遗传变异都是由于DNA序列变异而照成的，其变已有单碱基和多碱基突变（包括DNA重排、碱基替换、插入、缺失、异位、倒位等）和重复序列引起的变异。关键词：基因、分子
2、标记DNA、遗传、变异、应用、鉴定、定位一、 什么是分子标记技分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记是DNA水平遗传多态性的直接的反映DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。广义的分子
3、标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：具有高的多态性；共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； 能明确辨别等位基因； 遍布整个基因组； 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； 选择中性(即无基因多效性；检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)； 开发成本和使用成本尽量低廉； 在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换)但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。二、 分子标记技术的分类（一）、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是
4、利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。（二）基于PCR技术的分子标记技术（1）随机引物的PCR标记所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA区域事先未知。随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。（2）、特异引物的PCR标记特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有
5、特定核苷酸序列（通常为 1824 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。（三）基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记（1）扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法。AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，
6、最后在接头互补链的基础上添加 13个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3端的选择碱基序列（110 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而 AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP 结合了 RFLP
7、 和 RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管 AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。（2）酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )CAPS技术又称为PCRRFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(1927bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专
8、一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。GAPS标记揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。（四）基于DNA芯片技术的分子标记技术核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分
9、子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1000 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。SNP 被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技。三、分子标记技术在农业中的应用（一）物种或品种间的遗传关系PAPD、SSR、AFLP、等标记技术不需要先弄清扩增序列的结构，也不需要进行繁琐的Southern转移和分子杂交，即可对整个基因进行DNA分子水平上的多态性检测，同时可在短时间内分
10、析大量的样品，根据电泳图谱进行统计分析，为品种和品系遗传关系的确定提供了依据。目前，它在物种或品种间遗传关系方面已经得到广泛的应用。（二）品种（系）纯度的鉴定 众多的研究表明，任何物种的DNA指纹都具有程度不等的个体特异性。随即引物经PCR扩增后得到的产物多态性高，可以做指纹进行个体识别、物种鉴定及系谱分类。运用各种分子标记，在植物方面，分别对水稻、小麦、油菜、大豆、甘蓝、杨树等物种、品系、生理小种进行了鉴别。在动物方面，家猪、白鼠、鸡等也进行了DNA多态分析，构建了相应的指纹图谱用于不同品系的鉴定。（三）基因定位 根据样品的来源可用两种方法进行基因定位。一种方法是利用等位基因系；另一种是利用
11、分群分离分析法进行基因定位的。（四）作物病原真菌检测及昆虫生态种群研究 与蛋白质或同功酶电泳技术以及传统的形态学、生理缺陷、免疫学等方法相比，分子标记技术在研究生物种类变异方面具有信息量大、稳定、不受环境条件状态影响、不受组织材料限制等优越性，能够灵敏的个体间遗传变异，进而定量的描叙种群内遗传变异程度和群间遗传距离。因此他们是一种检测植物病院真菌、昆虫种群变异的一种简便、快捷、灵敏的方法。（五）目标基因早期鉴定 Chunwongse等用RAPD分析技术未发芽的水稻和部分胚乳鉴定F2个体的基因型，将具有双亲DNA标记的个体选出来，将其所对应的含胚的另一部分种子播种，从而达到早期、快速的选择目标基
12、因型的目的。（六）遗传图谱的构建 遗传图谱是各种生物遗传研究的重要内容，也是重要经济性状位点定位及分子克隆的研究的理论依据和基础。以前主要利用形态标记？生化标记和传统的细胞遗传学方法构建遗传图谱，近几十年分子标记的迅速发展大大的促进了遗传连锁图的构建。随着各类分子标记技术的发展及大量的多态片段的筛选，完全可以做出一张密集、详细的遗传图谱四 分子标记在应用中存在的问题及展望分子标记技术作为常规育种有力的辅助工具,其重要性早已为国际蔬菜育种界所公认, 但在蔬菜育种实践中还存在一些需要解决的问题。（1）除番茄和马铃薯以外, 大多数蔬菜植物图谱上的标记需要饱和。 （2）目前RFLP标记技术较为复杂,
13、需要的DNA多, 不易进行大量单株的鉴定需要将其转化为易操作的PCR 标记如STS、RAPD和SSR等。（3）在遗传标记自动化方面也取得了较大的进展, 如在DNA提取、定量、PCR扩增反应操作及数据的分析处理等方面实现了自动化或半自动化, 但多数仪器设备价格昂贵, 有些还需不断改进。（二）前景 分子标记的开发虽然只有短短20年左右的历史, 但已应用到植物育种的方方面面。随着分子标记在遗传学各领域的广泛应用, 各种标记分析技术已接近程序序化变得非常易于实施。分子生物学理论与技术的迅猛发展必将不断地开发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标志。因此, 随着研究工作的深入发展和实践上的需要, 分子标记技术将会日益实用和完善。结束语：随着社会的进步科学技术的发展，分子标记技术的应用将会越来广泛，相信在未来的许多的生物领域都将会用到分子标记技术，而且分子标记技术也将越来越完善。参考文献：1. 系统与进化植物学中的分子标记 作者： 邹喻苹 出版社：科学出版社 出版日期：2001/2/12.分子标记与小麦品质改良 作者： 郭世华 出版社：中国农业出版社 出版日期：2006/6/1 3. DNA分子标记技术在植物研究中的应用 作者 郭兴 图书出版社：化学工业出版社 出版日期 2008/8
