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1、Southern杂交基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之
2、一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上
3、的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。下面以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 步骤：一、 待测核酸样品
4、的制备 （一）制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织（或）细胞制备。1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。 （二） DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65加热灭活限
5、制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 （一）基本原理 Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.81.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA片段。原则是分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。
6、经过一段时间电泳后，DNA按分子大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带。另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA （DNA marker）进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。 （二） 基本步骤 1. 制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地戈辛杂交系统，所需DNA样品的浓度较低，每道加2.5-5g人类基因组DNA；如果基因组比人类DNA更复杂
7、（如植物DNA）则上样量可达10g；每道上质粒DNA5kb，则需进行脱嘌呤处理。 (1) 把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。 注意：处理人类基因组DNA10分钟；处理植物基因组DNA20分钟。 (2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中 2. 如果靶序列5kb，则直接进行下面的步骤 (1) 把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温215分钟，轻轻晃动。 (2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中 (3) 把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，Ph7.5，1.5mol/L NaCl），室温215分钟。 (4) 在20SSC中平
8、衡凝胶至少10分钟。 四、转膜 即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性能及使用情况五、探针标记 用于Sout
9、hern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。 六、预杂交（prehybridizafion） 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，
10、使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。具体步骤如下： （一） 配制预杂交液：6XSSC，5XDenhardts试剂，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入。注：1.每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2.预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.当使用32P标记的Cdna作探针时，可以在预杂交液或杂交
11、液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC含量为40%，则Thyb为42。） （二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。 （三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2SSC浸湿滤膜。 （四）将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。 （五）从塑料袋中除净2SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。 （六）加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200g
12、/ml。 （七）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42水浴中温育4h. 七、Southern杂交 （一）原理 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 （二） 步骤 1.将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。 2.从水浴中取
13、出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。 4.置42水浴温育过夜（至少18h）。 八、洗膜 取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2SSC/0.1%SDS，42，10min，1SSCC/0.1%SDS，42，10min，0.5SSCC/0.1%SDS，42，10min，0.2SSC/0.1%SDS，56，10min，0.1SSC/0.1%SDS， 56，10min。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针
14、进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。 九、放射性自显影检测 （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意同位素的安全使用） 结果及注意：在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题：转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差
