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1、DNA 重组和转化08 级生物学基地班 马新旺 学号320080941871【摘要】通过对大肠杆菌进行CaCl2处理，在冰浴、热水浴中使其成 为感受态细胞，使质粒转入大肠杆菌中，并在涂布有X-gal, IPTG和 氨苄青霉素的选择培养基中筛选重组和转化成功的目的菌。结果表 明：转化成功率较低,出现蓝斑数很少,而且出现了白斑。【关键词】 DNA 重组和转化 选择培养基 感受态细胞【引言】 pUC-19 质粒带有氨苄青霉素抗性基因,而宿主菌 JM109 对氨苄青霉 素没有抗性。在用 pUC-19 质粒转化 JM109 后,涂布到含有氨苄青霉素的培养 基上培养,没有被转化的菌不能生长,而被转化了的菌
2、可以正常生长,形成菌落。同时，pUC-19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有0 -半乳糖苷酶 基因（Lac Z）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。JM109宿主菌染色 体上带有Lac Z的C端部分编码信息，它们编码的肽段各自都不具有酶活性，但 它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来 ， 形成具有0 -半乳糖苷酶活性的 蛋白质。p -半乳糖苷酶催化生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-p -D-半乳糖苷（X-gal） 水解，产生蓝色产物，使菌落显示蓝色。【材料器械、试剂与方法】1. 材料器械1.1 材料大肠杆菌JM109；质粒pUC19 Vector ;小牛胸腺DNA;1.2 器械
3、高压灭菌锅，恒温振荡培养箱；恒温培养箱；台式离心机；超净工作台；2. 试剂（1）药品：KAc,HAc,Tris,HCl,Na EDTA,T DNA 连接酶，MgCl , 二硫苏糖醇2 4 2（DTT）,ATP，蛋白胨，酵母粉，NaCl,NaOH，琼脂，IPTG, X-gal, CaC*氨苄青霉素，EcoR 1,95%乙醇；2,（ 2）KAc 缓冲液（ pH4.8）,TE 缓冲液， T4DNA 连接酶缓冲液， LB 固体培养 基，LB 液体培养基，200mg/mL IPTG,80mg/mL X-gal, 50mg/mL氨苄青 霉素, 0.1mol/LCaCl , 70%乙醇。3. 方法 23.1
4、 配制选择培养基1. LB液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1g NaCl,加重蒸水100ml， 用 NaOH 调 pH 至 7.0，高压灭菌。（每组配 40ml）2. LB固体培养基：在40ml未高压灭菌的LB液体培养基中加1.5%琼脂， 高压灭菌后取出。当培养基冷却到约50C时，加入氨苄青霉素母液， 使其终浓度为60g/ml，摇匀后迅速倒成两个平板。（高压灭菌同时也 灭菌两套洗净的培养皿）3. 在超净工作台上，往倒好的每个平板培养基上涂布40l X-gal贮备 液（80mg/ml ）和4l IPTG贮备液（200mg/ml），将平板置于室温放 置 3-4h 直至液体被吸收。3.2 制
5、备感受态细胞1. 取大肠杆菌JM109划线培养过夜的单菌落接种到20mlLB液体培养基中， 置37C摇床于280rpm振摇培养约6h。2. 将细菌转移到一个无菌离心管中，冰上放置lOmin，使培养物冷却到 0C。3以4000rpm离心lOmin,回收细胞，弃上清，将管倒置使残留的痕量培 养液尽量流尽。4. 以 l.5ml 冰冷的 O.lmol/L CaCl2 悬浮沉淀，放置于冰浴。5. 以2000rpm离心lOmin，回收细胞且使培养液流尽。6. 取lml冰冷的O.lmol/L CaCl2悬浮细胞，将细胞分成200l 一份，装 入Eppendorf管中，置4C冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。
6、3.3 转化1. 取2管200l的感受态细胞，1管中加入4p l的pUC-19 DNA，另1 管为不加质粒DNA的对照，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min2. 将管放到42C水浴中1.5min，不要摇。然后在冰浴中迅速冷却2min。 （热激反应）3每管加入100l LB培养基，37C水浴中温育45min。3.4 培养1.取200l菌液加在含有氨苄青霉素及XGal和IPTG的选择平板培养 基上，用一无菌弯头玻棒轻轻将细菌涂在琼脂平板表面，将平板置于 室温直至液体被吸收。经质粒转化的细菌和未转化的对照各涂布一个 平板。2倒置平皿37C培养12-16h，对照培养皿中应无菌落出现，涂布有经质 粒
7、转化细菌的培养皿中长出蓝色菌落。3. 第二天上午观察结果，记录现象，并大致估计各皿的菌落数。实验结果】左图为对照组结果（涂布未添加质粒的大肠杆菌），右图为实验组结果（涂布添 加了质粒的大肠杆菌）。由图片可得重组和转化失败，没有成功，因为没有蓝色斑迹出现。【讨论】关于对照和实验组培养基中都长出白色斑点的分析。由实验组（右图）可知没有重组转化成功，因为没有蓝色斑迹（菌落）出现， 同时因为对照组是不加质粒而产生的结果不可能有蓝色斑迹（菌落），但是两者 都有白斑，这说明是氨苄青霉素失效（因为放置时间过长）。还有可能是因为转 化成功但IPTG浓度不够或者失效造成没能诱导B -半乳糖苷酶产生，也就没有底 物被催化而不会出现蓝色产物。致谢指导老师：沈老师、张老师 同组人员：万慧达以及其他同学的帮助支持； 参考书目生物化学实验和分子实验指导 沈剑敏 主编 兰州大学出版社 现代分子生物学 （第 3 版）朱玉贤 编著 高等教育出版社 实验二 DNA 重组转化 兰州大学 沈老师 分子生物学实验课件
