《实验七微生物细胞大小测定.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验七微生物细胞大小测定.doc（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验七 微生物细胞大小测定实验目的1了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造。2掌握用显微测微尺测量微生物细胞大小的方法。实验材料1菌种 啤酒酵母菌24h液体培养物；2其它 光学显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、盖玻片、载玻片、香柏油、擦镜纸。实验原理在一定条件下，各种微生物细胞的大小，是微生物形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于微生物细胞很小，只能在显微镜下测量，一般采用显微测微尺来测量。显微测微尺有镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺是在中央部分刻有精度等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度为10mm，用于校正目镜测微尺。目镜测微尺是一块可放在目镜内的圆形玻片，其中央一般有
2、100等分的小格。目镜测微尺可直接用于测量细胞的大小。由于不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的相对大小。球菌用直径来表示大小，杆菌用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8微米，枯草芽孢杆菌大小为0.7-0.8*2-3微米。实验内容（一）目镜测微计的校正1放置目镜测微尺取出目镜，旋开目镜，将目镜测微尺放在目镜的隔板上（有刻度的一面向下）
3、，然后旋上目镜，最后将此目镜插入目镜镜筒内。2放置镜台测微尺把镜台测微计放在显微镜载物台上（有刻度的一面向上）。3校正目测微尺用低倍物镜观察，对准焦距，通过调焦能看清镜台测微计的刻度；移动镜台测微尺和转动目测微尺使两者刻度平行；转动推进器从而使两测微尺某段起、止线完全重合，数出两条重合线之间的格数。用同法分别校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜时，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。4计算目测微尺每格的相对长度由于镜台测微尺每格长10微米，根据下面的公式即可计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。微尺的格数
4、两个重合刻度间目镜测微尺的格数两个重合刻度间镜台测10目测微尺每格的长度（mm）（二）测定啤酒酵母细胞的大小目镜测微尺校正完后，取下镜台测微尺，将啤酒酵母制成水浸片放在显微镜载物台上，用高倍镜观察，调至物象清晰后，转动接目测微尺，测量酵母菌细胞的长度和宽度分别占有几个格数，再将测得的格数乘以接目测微尺每格的相对长度即可求出酵母菌细胞的大小。要求在同一张片上测定5-10个酵母细胞并求出平均值，这样才能代表酵母细胞的平均大小。最后取出目镜测微尺，将目测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后放回盒子内，干燥保存。实验报告1、 将目镜测微尺校正结果填入下表物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺
5、每格代表的长度/微米低倍镜高倍镜油镜目镜的放大倍数2、将菌测定的结果填入下表微生物名称目镜测微尺每格代表的长度/微米宽长菌体大小范围/微米目镜测微尺格数宽度/微米目镜测微尺格数长度/微米酿酒酵母实验八 微生物的基本操作技术和细菌生长状态的观察实验目的：掌握细菌在固体、半固体和液体培养基上的接种方法并观察细菌的生长现象。实验材料：1、菌种：葡萄球菌、大肠杆菌等；2、培养基：肉膏固体培养基、肉膏液体培养基、肉膏半固体培养基、肉膏固体斜面培养基；3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。实验内容：一、平板划线接种法（分离出纯种细菌，以利作纯培养）。通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分地分散开，
6、使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。操作方法：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。2、左手抓握琼脂平板，在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂平板表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。4、第二
7、区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。5、划线完毕，将平板盖好皿盖并作好标记（在培养皿低部做标记），置37温箱孵育18-24h观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。菌落：单个细菌在固体培养基上生长繁殖形成肉眼可见的细菌集团。一个菌落由一个细菌生长而成的。细菌的菌落一般分为三种：光滑型菌落（S型菌落）、粗糙型菌落（R型菌落）和粘液型菌落（M菌落）二、液体培养基接种法（可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用）。1、右手握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。左手拇指、食指、中指托住液体培养基下端，右手小指和无名指（
8、或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图9）。3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37温箱孵育18-24h，取出观察生长情况。（1）均匀混浊生长，大多数细菌（兼性厌氧菌）。（2）菌膜形成，液体澄清或稍混（专性需氧菌），如：枯草杆菌。（3）絮状沉淀物，沉淀物上的液体仍清澈（专性厌氧菌），如：链球菌。三、半固体穿刺接种法（观察细菌动力，保存菌种）。1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种
9、针灭菌后放下。试管置37温箱孵育18-24h，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。穿刺线模糊：有鞭毛的细菌可沿穿刺线生长，并向四周游动扩散，使培养基混浊，穿刺线模糊。穿刺线清晰：无鞭毛的细菌只沿穿刺线生长，而线周围培养基仍透明澄清。四、斜面培养基接种法（常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种）。1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37温箱孵育18-24h，取出观察斜面上菌苔生长情况。实验九 细菌的革兰染色法实验目的：1、熟悉显微镜的使用方法与保养。
10、2、掌握细菌革兰染色标本的制作和原理。实验材料：1、葡萄球菌、大肠杆菌1824h培养物。2、结晶紫、碘液、95%的酒精、复红。3、载玻片、酒精灯、接种环、生理盐水、吸水纸、显微镜等。实验原理：革兰染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：1、等电点学说：革兰阳性菌等电点（pH23）比革兰阴性菌（pH 45）低，一般染色时染液的酸碱度在pH 7.0左右，在同一pH条件下电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。2、通透性学说：根据细菌细胞壁结构和组成不同用革兰氏染色法把细菌分为两类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成蓝紫色，碘作为
11、媒染剂，它与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增加了细菌与染料的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同。G+细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍然保留初染的蓝紫色。G-则不同，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁通透性增加，使结晶紫-碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 3、化学学说：革兰阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和
12、染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色，G+含量多，可与进入体内的碘液，结晶紫牢固结合成大分子复合物，G-含量很少，故容易脱色；实验方法：1、细菌染色片的制作（涂片-干燥-固定）同单染色法2、革兰氏染色法a、初染：将结晶紫染液滴加到已固定的标本片上，染色1min，水洗；b、媒染：滴加碘液媒染1min，水洗；c、脱色：滴加95%的酒精脱色，使无紫色为止，一般30s，水洗；d、复染：滴加复红复染1min，水洗，用洗水纸吸干，用油镜观察。注意事项：1、标本片不能涂的太薄或太厚，以免影响实验结果。2、革兰氏染色成败的关键在于脱色的时间。3、染色过程中不要使染色液干涸，用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。4、选用培养16-24h的细菌为宜。实验结果： 呈紫色者为革兰阳性菌，呈红色者为革兰阴性茵。葡萄球菌呈紫色，为革兰阳性菌；大肠杆菌呈红色，为革兰阴性菌。革兰氏染色法实际意义：1、鉴别细菌：将细菌分为G+和G-两类，便于初步识别细菌，缩小鉴定范围。2、选择用药：G+和G-对抗生素和化学制剂的敏感性不一样，大多数G+对青霉素、红霉素等抗生素敏感，而大多数G-对链霉素、氯霉素和庆大霉素敏感，临床上根据病原菌的革兰氏染色性，选择有效的药物治疗；3、致病特点：大多数G+主要以外毒素致病，大多数G-主要以内毒素致病。而且两者的致病机理和表现也不一样。
