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1、水产品中孔雀石绿的迅速检测胶体金免疫层析法(KJ201701)附件1水产品中孔雀石绿的迅速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1 范围本方法例定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析迅速检测方法。本方法合用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的迅速测定。2 原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标志的特异性抗体结合，克制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的联合，进而致使检测线颜色深浅的变化。经过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐
2、色孔雀石绿总量进行定性判断。3 试剂和资料除还有规定外，本方法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂正己烷。乙腈。冰乙酸。盐酸。吐温-20。氯化钠。对-甲苯磺酸。无水乙酸钠。盐酸羟胺。无水硫酸钠。中性氧化铝：层析用，100目200目。二氯二氰基苯醌。氯化钾。磷酸二氢钾。十二水合磷酸氢二钠。饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（），用水溶解并稀释至10mL，混匀。乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（）及0.95g对-甲苯磺酸（）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1
3、.3）调理溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（）置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈（）溶解并稀释至刻度，混匀。4避光保留。复溶液：称取8.00g氯化钠（），0.20g氯化钾（），0.27g磷酸二氢钾（）及2.87g十二水合磷酸氢二钠（）溶解于900mL水中，加入0.5mL吐温-20（），混匀，用盐酸（）调理pH为7.4，用水稀释至1L，混匀。3.2参照物质孔雀石绿、隐色孔雀石绿参照物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均90%。表1孔雀石绿、隐色孔雀石绿参照物质中文名称、英文名称
4、、CAS登录号、分子式、相对分子质量序号中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子质量1孔雀石绿MalachiteGreen569-64-2CHClN2364.9123252隐色孔雀石绿LeucomalachiteGreen129-73-7CHN2330.472326注：或等同可溯源物质。3.3标准溶液配制孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准贮备液（1mg/mL）：精细称取适当孔雀石绿、隐色孔雀石绿参照物质（），分别置于10mL容量瓶中，用乙腈（）溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为1mg/mL的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准贮备液。-20避光保留，有效期1个月。孔雀石绿标准中间液A（1g/mL）：精细量
5、取孔雀石绿标准贮备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1g/mL的孔雀石绿标准中间液A。临用新制。孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精细量取孔雀石绿标准中间液A（1g/mL）（）1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的孔雀石绿标准中间液B。临用新制。隐色孔雀石绿标准中间液A（1g/mL）：精细量取隐色孔雀石绿标准贮备液（1mg/mL）（）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1g/mL的隐色孔雀石绿标准中间液A。临用新制。隐色
6、孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精细量取隐色孔雀石绿标准中间液A（1g/mL）（）1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的隐色孔雀石绿标准中间液B。临用新制。3.4资料免疫胶体金试剂盒，合用基质为水产品或水。金标微孔。试纸条或检测卡。4 仪器和设施4.1移液器：200L、1mL和10mL。4.2涡旋混淆器。4.3离心计：转速4000r/min。4.4电子天平：感量为0.01g。4.5氮吹浓缩仪。4.6环境条件：温度1535，湿度80%。5 剖析步骤5.1试样制备取适当有代表性样品的可食部分或养殖用水，固体样品充分粉碎混匀，液体样
7、品需充分混匀。5.2试样的提取与净化水产品正确称取试样2g（精准至0.01g）置于15mL具塞离心管中，用红色油性笔标志，挨次加入1mL饱和氯化钠溶液（），0.2mL盐酸羟胺溶液（），2mL乙酸盐缓冲液（）及6mL乙腈（），涡旋提取2min。加入1g无水硫酸钠（），1g中性氧化铝（），涡旋混合1min，以4600r/min离心5min。正确移取5mL上清液于15mL离心管中，加入1mL正已烷（3.1.1），充分混匀，以4600r/min离心1min。正确移取4mL基层液于15mL离心管中，加入100L二氯二氰基苯醌溶液（），涡旋混匀，反响1min，于55水浴中氮气吹干。精细加入200L复溶液（
8、），涡旋混淆1min，作为待测液，立刻测定。养殖用水量取试样2mL置于离心管中，以4600r/min离心5min，移取200L上清液作为待测液。5.3测定步骤试纸条与金标微孔测定步骤汲取所有样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸510次使混淆平均，室温温育35min，将试纸条（3.4.1.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育58min，从微孔中拿出试纸条，进行结果判断。检测卡与金标微孔测定步骤汲取所有样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸510次使混淆平均，室温温育35min，将金标微孔中所有溶液滴加到检测卡（）上的加样孔中，温育58min，进行结果判断。5.4质控试验每
9、批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。空白试验称取空白试样，依据5.2和5.3步骤与样品同法操作。加标质控试验水产品正确称取空白试样2g或适当（精准至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100L或适当孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（），使孔雀石绿浓度为2g/kg，依据5.2和5.3步骤与样品同法操作。正确称取空白试样2g或适当（精准至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100L或适当隐色孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（），使隐色孔雀石绿浓度为2g/kg，依据5.2和5.3步骤与样品同法操作。养殖用水正确量取空白试样2mL（精准至0.01g）置于15mL具塞离心
10、管中，加入100L孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使孔雀石绿浓度为2g/L，依据5.2和5.3步骤与样品同法操作。6 结果判断要求经过对照控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判断。目视判断表示图见图1。6.1无效控制线（C线）不显色，表示不正确操作或试纸条/检测卡无效。6.2阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表示样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量高于方法检测限，判断为阳性。6.3阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或许检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表示样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量低于方法检测限
11、，判断为阴性。a)试纸条b)检测卡图1目视判断表示图6.4质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。7 结论孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量以孔雀石绿计，当检测结果为阳性时，应付结果进行确证。8 性能指标8.1检测限：水产品2g/kg，养殖用水2g/L。8.2敏捷度：敏捷度应99%8.3特异性：特异性应85%。8.4假阴性率：假阴性率应1%。8.5假阳性率：假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A。9其余本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者供给方便，在使用本方法时不做限制。方法使用者在使用代替试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行观察，应知足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为GB/T198572005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定或GB/T203612006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法（包含所有的改正单）。本方法使用试剂盒可能与结晶紫和隐色结晶紫存在交错反响，当结果判断为阳性时应付结果进行确证。附录A定性方法性能计算表表A.1性能指标计算方法样品状况a阳性阴性总数2明显
