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1、聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP) 实验 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。 PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自
2、身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及
3、基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相
4、比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。一、试剂准备PCR相关试剂-32P-dCTP30聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 OC保存。10过硫酸胺配制方法：1g 过硫酸胺，溶于10ml ddH2O中，4 OC保存（可用数周）。TEMED（N，N，N，N，N-四甲基乙二胺） 5TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7变性上样液：95% 甲酰
5、胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步骤 PCR扩增 反应总体积为10l，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分： 10buffer 1l dNTPmix 70M DNA模板 100ng 引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入 -32P-dCTP 0.1l 加ddH2O至 10l 按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95乙醇擦拭，自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上， 510min后再用软纸擦拭除去多余
6、的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。 制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用58的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气（开始时要缓慢）除气泡，加 35l TEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液，将玻璃模具倾斜成60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加
7、些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去，放入电泳槽，凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入 1TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。 扩增产物的处理：将 PCR扩增产物与变性上样液按1：5的比例加入0.5ml微量离心管中，混匀。样品上胶前应98 o C变性10min，立即冰浴骤冷。取约35l变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。 电泳：电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，
8、根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l5Vcm电泳。 剥胶：电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。放射自显影：在暗室中将X线片贴于胶面，盖严片夹，用黑布将X线片夹包裹，置-70OC放射自显影。曝光时间根据同位素的强度而定，约 24h10d。 冲洗胶片从-70oC取出X线片夹，在暗室内迅速取出X线片，立即
9、显影，以免使X线片上出现过多的冷凝水。（如果想再得到一张放射自显影影像，可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温，并擦去冷凝水后再装入新的X线片）。依次按以下程序操作进行显影： X线片显影液显影 1-5min 水洗 lmin 定影液定影 5min 流动水冲洗 15min 所有使用液的温度应为1820OC为宜。三、注意事项 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，SSCP可发现其中70的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片
10、段，则仅能检出103O的变异，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有
11、助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用23种条件做SSCP，可能提高敏感性。 电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。 凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。 凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重
12、要，一般使用58的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。 假阴性: 一般认为，如没有污染，PCRSSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。8. 结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带因此，PCRSSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。
