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1、实验二、粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养技术（Counting, isolation and sporulation technology for coccidial oocysts in feces）转载自百度文库：河南科技大学动物科技学院闫文朝博士文章麦氏虫卵计数板产品链接：http:/ 认识动物常见重要球虫卵囊的形态特征；掌握粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养基本操作方法。这些操作是实验室开展球虫研究最常用的实验技术。【基本原理】 卵囊通常存在于宿主粪便中，从粪便中分离球虫卵囊的方法有饱和食盐溶液漂浮法、饱和蔗糖溶液漂浮法和饱和硫酸镁溶液漂浮法，其中最常用的方法为饱和食盐溶液漂
2、浮法。其原理是悬浮溶液如饱和食盐溶液密度高于卵囊密度，而低于粪便中大多数杂质，经离心或静置沉淀后，大部分杂质沉淀在容器底部，卵囊漂浮在悬浮溶液的表面，然后收集表层漂浮物；由于卵囊比重大于水的比重，所以表层漂浮物用自来水稀释离心后，卵囊沉淀富集于离心管底部即可得到大量球虫卵囊。计算球虫感染强度即每克粪便中卵囊数量（oocysts per gram, OPG）和保存卵囊悬液中卵囊数量通常用麦克马斯特法(McMasters method)和血细胞计数板计数法，应用最广泛的是麦克马斯特法。麦克马斯特计数法的原理是用饱和食盐溶液作为悬浮溶液，把卵囊与比重较大杂质分开，使卵囊漂浮至计数室表层，与计数室上层
3、刻度部分处在同一层面上（或同一视野内）；计数板上每个计数室容积为110.15=0.15mL（如图1示），镜检计数0.15 mL计数室内卵囊数量，最后根据粪便克数和悬液稀释倍数计算OPG值或单位体积内卵囊浓度。图1 麦克马斯特计数板结构示意图在适宜的温度通常25-28，湿度和充足的氧气条件下，球虫卵囊在体外进行减数分裂，一个卵囊内形成4个孢子囊，每个孢子囊内通过有丝分裂产生2个子孢子。由于粪便中大量的杂质影响氧气扩散，杂菌生长消耗氧气，使卵囊发育不良，因此孢子化培养最好在分离后进行。最好的培养液是2.5%重铬酸钾溶液，最适宜的培养温度是28，培养过程中需要搅拌振荡或吹气以达到增氧目的。不同种类球
4、虫卵囊孢子化时间有差异，通常在4872h。用次氯酸钠处理孢子化卵囊除去污染的细菌和真菌，延长卵囊保存时间。【器材准备】1、 试剂材料：新鲜鸡粪便，饱和食盐溶液，2.5%重铬酸钾溶液。饱和食盐溶液的配制：称取400g食盐，放入三角烧瓶中，加入1000 mL沸水，搅拌充分溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水，比重约为1.18。2.5%重铬酸钾溶液的配制：2.5g重铬酸钾固体加入100 mL蒸馏水，搅拌完全溶解即可。2、仪器用具：低速离心机，托盘天平，显微镜，麦克马斯特计数板，恒温培养箱，空气浴恒温摇床，增氧泵，手动计数器，200mL锥形瓶，平皿，载玻片，盖玻片，胶头滴管。【实验步骤】1、球
5、虫卵囊的形态学观察认识和了解球虫卵囊包括未孢子化和孢子化卵囊的一般形态结构特征，是进行动物球虫卵囊的计数、收集分离和孢子化培养的前提。球虫未孢子化卵囊：不同种属未孢子化卵囊共同特征是卵囊内呈现一团原生质，包含核质、各种细胞器等结构。其他结构如卵囊形状、大小以及卵囊壁结构与孢子化后相同（如图2所示）。艾美耳属孢子化卵囊：均有4个孢子囊，每个孢子囊内包含2个子孢子。不同虫种的卵囊形态、大小、有无卵膜孔、极粒、卵囊残体和孢子囊残体等特征存在差异。（如图3所示）等孢属孢子化卵囊：均有2个孢子囊，每个孢子囊内包含4个子孢子。其他结构特征随虫种而存在差异（如图4所示）。温扬属孢子化卵囊：均有4个孢子囊，每
6、个孢子囊内包含4个子孢子。其他结构特征随虫种而存在差异（如图5所示）。泰泽属孢子化卵囊：卵囊内存在8个子孢子和卵囊残体，无孢子囊结构（如图6所示）。图2 球虫未孢子化卵囊结构示意图图3 艾美耳属球虫孢子化卵囊结构示意图1，极帽；2，卵膜孔；3，极粒；4，孢子囊；5，孢子囊残体；6，卵囊残体；7，子孢子图4 等孢属球虫孢子化卵囊结构示意图1，孢子囊；2，子孢子；3：孢子囊残体图5 菲莱氏温扬球虫卵囊1.孢子囊；2.子孢子；3.残体图6毁灭泰泽球虫卵囊1，子孢子；2，残体2、球虫卵囊的计数2.1粪便中球虫卵囊的计数麦克马斯特法取2g新鲜鸡粪便置于干净的100mL烧杯内，先加入8mL饱和食盐溶液，用
7、玻棒捣碎混匀，再加入50 mL饱和食盐溶液，混匀后立即用纱布或60目筛网过滤，然后立即吸取滤液充满2个计数室，在显微镜载物台上静置35min，在10倍物镜下镜检计数，每个计数室内有100个方格，其体积为1cm1cm0.15cm=0.15mL, 分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，最后按照如下公式计算每克粪便中卵囊数量(OPG值)：OPG= (n1+n2)/(20.15)602其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数，0.15为每个计数室有效体积为0.15 mL，60为粪液总体积为60 mL，2为所用粪便克数为2g。2.2 保存卵囊悬液中活性卵囊的计数麦克马斯特改良法（1
8、）每毫升卵囊悬液中卵囊总数量（包括孢子化和未孢子化卵囊）：按照卵囊悬液：饱和氯化钠溶液1：9的比例混合均匀，迅速从上缘注入计数室内，在显微镜载物台上静置35min，待卵囊漂浮到上层；然后用10物镜下观察并计数，每个计数室内有100个方格，其体积为1cm1cm0.15cm=0.15mL,分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，然后计算每毫升卵囊悬液中卵囊总数量M，按照如下公式计算： M=(n1+n2)/(20.15)10其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数，0.15为每个计数室有效体积为0.15 mL，10为原卵囊悬液稀释10倍。如果视野内卵囊数量太多（每个方格内10-5
9、0个为宜），可适当倍比稀释后再按上述方法计数。（2）卵囊孢子化率计算吸取少量卵囊悬液，滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于40物镜下观察，并计算孢子化卵囊所占的比例a%。最后计算上述每毫升卵囊悬液中孢子化卵囊数量 N=Ma%。在致病性实验和药物实验中，接种卵囊剂量应该为完全孢子化卵囊的数量。2、球虫卵囊的分离收集取一定量球虫卵囊阳性粪便（根据实验需要称取适量粪便）置于干净烧杯内，先加入少量自来水用玻棒捣碎混匀，再加入35倍粪便体积的自来水，混匀后用6080目筛网过滤，重复水洗粪便23次，最后弃去残渣。对滤液进行30004000r/min离心沉淀6min，弃上清，沉淀用玻棒搅匀加5倍体积的饱和氯化钠溶
10、液，30004000r/min离心漂浮6min；小心倒出上清于另一干净烧杯内，弃去沉淀。然后用自来水5倍稀释上清，30004000r/min离心沉淀6min，然后弃去上清，重复水洗操作2次洗去卵囊沉淀中的盐分。最后沉淀用2.5%重铬酸钾溶液悬浮，镜检分离卵囊情况。3、卵囊孢子化培养与保存将上述步骤2中分离收集的卵囊放入10倍以上体积的2.5%重铬酸钾溶液中，于28摇床内振荡孢子化培养48h72h，或放入500mL玻璃瓶用微型增氧泵吹气孢子化培养48h72h，或手动吹打振荡孢子化培养48h72h（手动增氧时液体深度不能高于7mm），培养期间镜检孢子化率达8090%即可停止培养。为了防止细菌和真菌
11、的污染，长期保存孢子化卵囊，可以将收集的卵囊离心沉淀，向沉淀物中加入5倍体积的比重为1.075的次氯酸钠溶液，振荡混匀，冰浴处理10min，然后用PBS离心洗涤2次。然后再加入10倍体积的2.5%重铬酸钾溶液混匀后，保存于4冰箱备用。【注意事项】1、 采集的粪样一定要新鲜，避免污染，引起误诊。2、 饱和食盐溶液一定要饱和，其评价标准是沸水溶解食盐冷却后，有少量晶体盐析出。3、 离心前样品要用托盘天平配平，保证离心机转子平衡，避免出现安全问题。4、 漂浮离心后，含有卵囊的悬浮液至少用自来水稀释5倍以上，方可保证绝大多数卵囊沉淀到离心管底部。5、 计算粪便中OPG值时，从过滤粪便悬液到镜检计数，操
12、作要连贯快速，不要间歇，避免卵囊因漂浮造成在粪液中分布不均匀，导致计数不准。另外，粪便滤液注入计数室时要避免气泡产生，在显微镜载物台上要静置3-5min，保证卵囊上浮至计数室上层。6、 计数时，如果视野中卵囊太多（每个小方格10-50个卵囊为宜），用饱和盐水适当稀释后再计数。每个小方格内卵囊太多或太少，均影响计数的准确度。7、 孢子化培养时，局部环境温度不能低于20高于30；用搅拌或吹打方式增氧时，重铬酸钾溶液深度不能超过0.7cm。8、 未孢子化的卵囊不能在4或-20环境下存放，否则会严重影响卵囊的孢子化发育。9、 判断卵囊是否完成孢子化的标准是有80%90%的卵囊完全孢子化，如果孢子化时间
13、过长，过度消耗子孢子能量，反而会影响卵囊活性，缩短孢子化卵囊的保存时间。10、在次氯酸钠灭菌处理过程中会产热，时间过长会影响未孢子化卵囊的孢子化率。因此，被灭菌卵囊应为孢子化卵囊，灭菌过程必须冰浴和定期振荡散热。【实验报告】1、 绘制艾美耳属球虫的孢子化卵囊示意图，并标明主要结构特征。2、 简述粪便中球虫卵囊马克马斯特计数法的操作过程，并说明操作注意事项。【参考资料】1、鸡、猪、兔、犬和猫球虫常见种类世界公认，鸡球虫共有7个种，其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫(E. necratrix)致病性最强；感染猪的有等孢属(Isospora)和艾美耳属球虫多个种，其
14、中猪等孢球虫(I. suis)致病性最强；目前国外认定家兔艾美耳属球虫有11个有效种，其中肠艾美耳球虫(E. intestinalis)、黄艾美耳球虫(E. falvescens)和斯氏艾美耳球虫(E. stiedai)强致病种；犬等孢球虫（I. canis）和猫等孢球虫（I. felis），形态结构与猪等孢球虫相似，但致病性中度或轻微。图7 从鸡场粪便中分离的多种艾美耳球虫卵囊多数为未孢子化卵囊，初步判断该鸡场感染5种球虫：1为巨型艾美耳球虫，2为布氏艾美耳球虫，3为堆形艾美耳球虫，4为柔嫩艾美耳球虫，5为毒害艾美耳球虫。图8 鸡7种艾美耳球虫孢子化卵囊a为巨型艾美耳球虫，b为布氏艾美耳球虫
15、，c为柔嫩艾美耳球虫， d为毒害艾美耳球虫,e为早熟艾美耳球虫，f为堆形艾美耳球虫，g为和缓艾美耳球虫图9 家兔11种艾美耳球虫孢子化卵囊1为小型艾美耳球虫，2为斯氏艾美耳球虫，3为无残艾美耳球虫， 4为大型艾美耳球虫,5为穿孔艾美耳球虫，6为中型艾美耳球虫，7为维氏艾美耳球虫，8为盲肠艾美耳球虫，9为肠艾美耳球虫，10为黄艾美耳球虫，11为犁形艾美耳球虫ABC图10 犬等孢球虫(A)、猫等孢球虫(B)和猪等孢球虫(C)2、盲肠病变记分标准在药物治疗试验或疫苗保护效果评价试验中，盲肠病变记分用来评价柔嫩艾美耳球虫感染病变的严重性。在接种后第7 天，断颈处死所有试验鸡，按照Johnson和Reid(1970)设计标准进行盲肠病变记分，两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准：0分：无肉眼病变；1分：盲肠壁有很少量散在出血点，肠壁不增厚，内容物正常；2分：病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚；3分：盲肠内有多量血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样块状物），盲肠壁增厚明显，盲肠内粪便量少；4分：因充满大量
