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1、 生物医药工程系2011届本科毕业论文核桃多酚氧化酶（PPO）特性的研究专 业 生物科学 学 号 学生姓名 指导教师 完成时间 2011-6-10 陕西 商洛目 录摘 要3Abstract41前 言11.1多酚氧化酶的概述11.1.1多酚氧化酶的性质11.1.2多酚氧化酶的种类11.1.3多酚氧化酶催化的反应11.2国内外对多酚氧化酶特性的研究概况21.2.1国外对多酚氧化酶特性的研究21.2.2国内对多酚氧化酶特性的研究21.3核桃产业在我国的发展前景21.4核桃多酚氧化酶特性研究的意义31.4.1改善核桃产品的贮藏和加工适性31.4.2提高核桃产品的经济价值32材料与方法32.1材料与仪器
2、32.1.1供试材料32.1.2试剂32.1.3主要仪器32.2方法32.2.1多酚氧化酶粗酶液的提取32.2.2 PPO活性的检测42.2.3单因子试验42.2.3.1温度对PPO活性的影响42.2.3.2加热时间对PPO活性的影响42.2.3.3 pH值对PPO活性的影响42.2.3.4不同抑制剂对PPO活性的影响42.2.4正交试验43结果与分析53.1温度对PPO活性的影响53.2 加热时间对PPO活性的影响53.3 pH值对PPO活性的影响63.4不同抑制剂对PPO活性的影响63.4.1不同浓度柠檬酸对PPO活性的影响63.4.2不同浓度抗坏血酸对PPO活性的影响73.4.3不同浓度
3、亚硫酸氢钠对PPO活性的影响73.4.4不同浓度醋酸对PPO活性的影响83.4.5分析83.5正交试验94结论10参考文献11致 谢12摘 要目的 结合当地优势植物资源，进行核桃PPO特性的研究，以期对核桃的贮藏和加工特性提供参考。方法 以核桃为原料，提取PPO粗酶液，使用分光光度法测定PPO活性。单因子实验分别采取温度、加热时间、pH值及不同抑制剂对PPO活性的影响；在单因子实验的基础上，采用正交实验法进行多因子实验，并确定抑制PPO活性的最佳条件。结果 单因子试验表明：加热温度和时间对核桃中PPO活性具有明显的影响，在pH6.0时，80 下加热10min PPO活性几乎被钝化；抑制剂对核桃
4、中PPO活性也具有明显的影响，分别在柠檬酸浓度为0.17 mol/L，抗坏血酸浓度为0.56 mol/L，亚硫酸氢钠浓度为0.25 mol/L时，PPO的活性得到有效的抑制。L9（33）正交试验结果则表明对核桃PPO的抑制效果依次为：加热温度抗坏血酸浓度柠檬酸浓度，即ACB。综合结果进行极差分析得出最佳抑制组合水平为A3B1C1。结论 L9（33）正交试验得出对PPO活性影响的最佳组合水平为：加热温度82，柠檬酸浓度0.10 mol/L，抗坏血酸(Vc)浓度 0.4mol/L。关键词：核桃；PPO；活性；抑制AbstractObjective With the advantage of the
5、 local plant resources, the research on walnut PPO characteristics is to the storage and the processing for walnut.Methods With walnut as raw materials, coarse enzyme extraction liquid, use PPO photometry PPO activity. By single factor experiment temperature, heating time were taken, pH value and di
6、fferent inhibitors on the influence of PPO activity; On the basis of single factor experiment, using the orthogonal experiment method, and multiple factor experiment to determine the optimum condition of inhibiting PPO activity.Results The single factor text: The heating temperature and time have ob
7、vious effects to walnuts PPO. When the pH value is 6.0 and the heating temperature reaches 80 after 10min, the PPO in walnut is almost passivated. Citric acid concentration is 0.17 mol/L, ascorbic acid concentration is 0.56 mol/L. and odium hydrogen sulfite concentration is 0.25 mol/L, the activity
8、of PPO is effectively restrained. Through L9（33） orthogonal test, we find out the inhibition to the PPO of walnut: the heating temperature the ascorbic acid concentration the citric acid concentration (Vc),promptly ABC. Comprehensive results and range analysis, we found out the best suppression comb
9、ination level is A3B1C1. Conclusion L9（33）orthogonal experiment obtains the best combination level: heating temperature 82 + 0.10 mol/L citric acid concentration + 0.40mol/L ascorbic (Vc) acid concentration.Key words: Walnut; PPO; Active; Inhibition121前 言1.1多酚氧化酶的概述1.1.1多酚氧化酶的性质多酚氧化酶(Polyphenol oxid
10、ase,PPO)早在1895年就被发现，直至1937年才被分离得到1。它在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一2。自20世纪60年代以来，曾从不同的植物中分离出来，如马铃薯、苹果、山药、小麦、百合、蘑菇、芦笋、梨等。PPO是一类广泛存在的含铜金属酶类。已知PPO不仅广泛存在于各种果品和蔬菜中,还存在于微生物及动物体内3。PPO往往催化食品原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，称之为酶促褐变4,5该酶对于果蔬的加工和保鲜的重要性主要是涉及到新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。除了影响加工产品的色泽外，还会产生不良风味6。1.1.2多酚氧化酶的种类随着研究的深入，PPO
11、大体可分为以下几类：单酚氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.10.3.2）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2）和漆酶（laccase,EC.1.10.3.1）1。习惯上常把儿茶酚氧化酶称为儿茶酚酶、酪氨酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶或甲酚酶，它与漆酶有明显的区别。儿茶酚酶不是严格存在于植物体的特定部位，它普遍存在于植物的器官和组织中；漆酶的催化底物范围很广，它可以催化单酚、三酚、邻和对二酚以及氨基酸。现在所说的PPO一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。1.1.3多酚氧化酶催化的反应PPO以氧作为受氢体，是一种线粒体外的末端氧化酶，它能催化两类反
12、应：一类是元酚羟基化，可以生成相应的邻-二羟基化合物；第二类是催化邻二酚氧化生成邻醌4。两类反应都需要分子氧参与。在PPO催化邻二酚转变成邻醌后，无需酶的催化将自动进一步聚合形成褐色素或黑色素。这就是食品发生酶促褐变引起食品色泽发生变化的主要原因之一。水果和蔬菜中含有许多种类的酚类化合物，其中有一部分酚类可以作为PPO的底物。果蔬中，PPO最丰富的基质底物是邻二酚类和一元酚类。反应最快的是邻羟基结构的酚类，对位二酚类也可以氧化，单间二酚则不能被氧化，甚至对PPO还有抑制作用。邻二酚羟基的取代衍生物也不能被PPO所催化，如愈疮木酚（邻甲氧基苯酚）及阿魏酸等。PPO在有氧的条件下催化形成醌，从而引
13、起褐化。但是，植物体内大多数PPO的活性都是潜在的1。这是因为正常组织内细胞中的酚类物质和PPO呈区域性分布。在代谢过程中，PPO的作用主要体现在衰老和受伤的情况。PPO对于解释由于受伤而出现醌类物质的快速产生，从而进一步引起褐变死亡具有很明显的生理意义。1.2国内外对多酚氧化酶特性的研究概况1.2.1国外对多酚氧化酶特性的研究在国外，PPO首先由Yoghid于1883年在日本漆树研究过程中发现，1938年KeilinD.和MannG.在对蘑菇的研究中实现了蘑菇PPO的提取和纯化，并将其命名为polyphenol oxidase7。由于其与食品加工和蔬菜保鲜与贮藏运输有着密切的关系，之后一直是
14、研究的热点，尤其在其生化、生理学性质方面取得了较大的进展。1.2.2国内对多酚氧化酶特性的研究在国内，从二十世纪六十年代就开始了对PPO的研究，其一直是食品保护方面研究的热点。曾从各种果品和蔬菜中，及微生物和动物体内分离出来。PPO是食品发生酶促褐变的条件，而食品发生酶促褐大多是不利的，甚至会带来严重的不良后果。人们通过研究PPO发现许多条件能够影响酶促褐变的发生。必须具备的条件有三个：底物（多酚类物质）、氧和PPO。这三个条件缺一不可。PPO与植物组织的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。PPO分布广泛，酶促褐变也很普遍，因此控制褐变的发生条件，从而控制、抑制褐变显得十分重要。实际操作中，从食品中
15、除去PPO的底物（多酚类物质）不仅困难，而且不现实。因此，比较有效的抑制PPO活性，其次是防止与氧接触。实际应用上控制酶促褐变的常用方法有：热处理法、酸处理法、加入抑制剂、SO2及亚硫酸盐处理、驱除氧气或隔绝氧气法3。近年来，人们从生物学本身多方位地对PPO开展了研究，虽有研究表明多酚氧化酶是促使酶促褐变的主要原因，但是其生理功能及特性，还需要进一步的研究。1.3核桃产业在我国的发展前景核桃，又名胡桃，含有蛋白质14.9、不饱和脂肪酸5.8、碳水化合物9.6，且含有丰富的矿物质以及维生素8，具有增强人体免疫力、补脑、安神、润肺、乌发等特殊功效，对减少肠道胆固醇的吸收、防治动脉硬化、高血压、冠心病以及老年人抗衰老均有良好的效果，是制备保健性蛋白饮料的理想原料。现代医学研究表明，核桃仁具有健脑、益智、养颜、补气、养血、化痰、治喘等多种保健医疗功效，使其成为二十一世纪最有加工优势的果品之一9。核桃在我国的分布十分广泛，品种多，资源丰富。目前，世界核桃产量中，我国产量第一，美国产量第二，土耳其产量第三。核
