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1、一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清试剂:（1）0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液：0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO42H2O17.8g溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4保存。0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml, 4保存。将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4保存。（2）标准丙酮酸
2、（含丙酮酸2.0mol/mL） ： 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。（3）SGPT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml) :取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH 7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。（4）GOT底物液(DL天冬氨酸200mmol/L ,-酮戊二酸 2mmol/L):称取- 酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢
3、氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。（5）2.4-二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/L NaOH溶液:称取16g固体NaOH，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL，备用。操作步骤：1、 标准曲线绘制：取试管18支按下表操作。试 管 号对 照12345丙酮酸标准液（1毫升2微克分子）00.050.100.150.200.25SGPT或SGOT底物0.500.450.400.350.300.2
4、50.1M磷酸盐缓冲液PH7.40.10.10.10.10.10.1相当于谷丙转氨酶单位0285797150200相当于谷草转氨酶单位02461114190每个样做3个平行，置37水浴30分钟，各管加2，4-二硝基苯肼液0.5mL，混匀，再在37水浴中放置20mL，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸光值均减去空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。试剂样品
5、测定（每个样3个平行）对 照（每个样3个平行）血 清（mL）0.10.1SGPT或SGOT底物（mL）0.5置37水浴30分钟（SGOT为37，60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴）2.4-二硝基苯肼（mL）0.50.5置37水浴20分钟SGPT或SGOT底物（mL）0.5NaOH溶液（mL）5.05.0对照及样品各做3个平行，充分摇匀，静置10分钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力。l 谷丙转氨酶活性单位： 37， pH7.4，每小时每毫升血清催化生成1mol 丙酮酸为1个单位。例：0.1ml血清每小时催化生成0.1mol丙酮酸,
6、即相当于GPT 100U / 100ml 血清。l 注意：1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20500U是准确可靠的，超过 500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于L氨基酸，对D氨基酸无 作用。实验室多用DL氨基酸（较L氨基酸 价廉），若用L氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高， 会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠
7、的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管优点：尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他比色法准确.故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法.1981年全国常规生化检验方法学术讨论
8、会认为赖氏法测定ALT活性较为合理, 缺点：由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足,反应速度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应后,新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大.* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm 的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。* 国际单位：在最适温度（25）下，1分钟产生1mol丙酮酸的酶量为1个活性单位，即1IU=1umo
9、l/min。* King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生 成1mol丙酮酸称为一个单位。 * Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。二、尿素氮（BUN）（二乙酰一肟法尿素测定）（一）仪器设备：水浴锅、紫外分光光度计、10mL试管（二）试剂：1、 尿素氮试剂：蒸馏水100mL，浓硫酸44mL，85%磷酸66mL，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg，硫酸镉（3CdSO48H2O）2g，溶解后稀释至1000mL。2、 20g/L二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g，加入蒸馏水溶解，定容至10
10、00mL。3、 尿素氮标准贮存液（357mmol/L）：称取尿素1.072g溶解于蒸馏水中定容至1000mL，至于棕色瓶中贮存。4、 尿素氮标准应用液（17.85mmol/L）：取贮存液5mL，加蒸馏水定容至100mL。（三）操作步骤按下面表格的试剂配比操作：试剂测定管标准管空白管血清（ml）0.02-尿素氮标应用准液（ml）-0.02-蒸馏水（ml）0.02二乙酰-肟试剂（ml）0.50.50.5尿素氮试剂（ml）5.05.05.0按上述表的配方每个样做3个平行样，混匀，置沸水浴中加热15min，立即用自来水冷却5分钟。分光光度计选用540nm波长，以空白管调零点，读取各管吸光度。尿素（mg
11、%）=测定管吸光度/标准管吸光度17.85(mg/ml)n 1. 此法灵敏度高，用量极微（一般只需0.02ml血清即可）。本实验是先将血清用生理水以1：4加以稀释再取0.1ml，故最后计算时，应乘以稀释倍数“5”n 2. 试剂中加入硫胺脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象（小于5%/h）。n 3. 此法操作简单，特异性强，不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸、肌酸等影响，但应控制好实验条件。n 4. 吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。n 5.尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。由于尿液中尿素氮含量高，标本需用蒸馏水以1:50稀释。如果呈色后吸光度仍超过本法的线
12、性范围，还需将尿液再稀释，重新测定。n 3尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个氮原子，因此1mmol/L尿素等于2 mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐使用尿素，并以mmol/L表示浓度单位，我国卫生部也已规定一律使用尿素，不再使用尿素氮一词。 n尿素氮mg% = 测定管/标准管0.002100/0.15 = 测定管/标准管10 【参考范围】 5-20 mg/dl 三、肌酐（Cr）四、血糖（Glu）（邻甲苯胺法）血糖是指血液中的葡萄糖，葡萄糖与冰醋酸、邻甲苯胺共热时，葡萄糖先脱水转化为羟甲基糠醛，再与邻甲苯胺缩合为蓝绿色的薛夫碱，其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。可用比色法进行定量测
13、定。 1、仪器：紫外分光光度计、水浴锅2、试剂：（1） 葡萄糖标准母液 （10mg/ml，用饱和苯甲酸溶液配制）（2）邻甲苯胺溶液： 2.5g硫脲溶于冰醋酸，加入邻甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸定容至1升。3、操作步骤：（1）配置不同浓度葡萄糖标准溶液：取5支10ml容量瓶，标号，依次加入葡萄糖母液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml，用饱和苯甲酸稀释至10ml，混匀（则上述溶液100ml葡萄糖含量为25，50，100，200，300mg ）；（2）分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管中，设平行管，空白管加0.1mL蒸馏水，各管加入邻甲苯胺试剂5.0mL，混匀后
14、，置沸水中 15分钟，立即移入冷水浴中冷却；（3）以空白号管调零，于紫外分光光度计波长630nm 处测吸光值，以各管的吸光度为纵坐标，相应管中葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得出线性方程。（4）测试样品：取全血0.1mL，设平行样，按上述方法测出其A630nm吸光值，通过线性方程求出其血糖含量。试剂（mL）012345邻甲苯胺试剂5.05.05.05.05.05.0不同浓度葡萄糖标准溶液00.10.10.10.10.1蒸馏水0.100000100mL全血相当于葡萄糖质量mg02550100200300A630nm0.000注意事项： 1. 本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物质基本上无影响。 2. 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定，24小时内无变化。如将加热时间缩短，生成颜色容易消褪。 3. 轻度溶血的血清对结果无明显影响。根据推导，血清中含血红蛋白 450毫克/100毫升时，可使测定结果降低约10%。
