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1、腹水抗体制备(实验室级别)2012-8-27一、实验原理： 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其 以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。二、实验材料：药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机三、制备步骤：1.打石蜡在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促 进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；2. 杂交瘤细胞复苏与扩大培养(1) 12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。(2) 按冻存细胞的液氮罐位置，取
2、出冻存的细胞管，在37C水浴箱中搅动1min左右，快速 融化冷冻的杂交瘤细胞。(3) 将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后平衡EP管， 800rpm, 8min,进行离心。(4) 将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，按 1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否 有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。3. 杂交瘤细胞收集与注射(1) 待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清 1ml 后，吹打细胞，使贴壁细胞脱落， 然后收集到15ml离心管中，800rpm， 8min离心，(2)
3、吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条件再次离心， 弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只， 注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态， 防止小鼠死亡。4. 腹水收集(1) 取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹部上皮，撕 开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再 吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹 水抗体。(2) 正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗
4、体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/管，用1.5mlEP 管分装后放-80C冻存。5. 抗体纯化(1) ProteinG亲和层析柱准备:填料(1ml)装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10 个柱床体积平衡柱子。(2) 上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至lml上柱。(3) 洗涤：平衡缓冲液洗 5-10 个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显色反应为止(4) 洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗脱液立即用 中和缓冲液中和到中性。(5) 平衡层析柱：立即用5-10 个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。(6) 再生：再生缓冲液流洗2-3 个柱床体积。(7) 保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5 个柱床体积。层析柱内保留适当体积 的20%乙醇，置于48C保存。
