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1、病毒诱导的基因沉默摘要:病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing ,VIGS）是近年发现的一种转录后基因沉默的现象，是迅速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术，近年来成为植物基因功能研究的有力工具。文章从病毒诱导基因沉默的发现、类型、作用机制、优势及局限性、影响条件及对发展前景的展望等方面进行了综述。核心词:病毒诱导的基因沉默；机制；应用；基因功能因功能RNA介导的基因沉默(RNA- mediated gene silencing)是一种通过核酸序列特异性的互相作用来克制基因体现的调控机制，它广泛存在于多种生物中,在植物中称为转录后基因沉默(post-tra
2、nscriptional gene silencing , PTGS)1。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS)属于转录后的基因沉默，指携带植物功能基因cDNA 片段的重组病毒，在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而浮现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功能.VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术，发展迅速，已广泛应用于生物学诸多领域的研究。1 VIGS的建立与发展VIGS一词最早浮现于van Kammen2对病毒侵染后产生的答复现象的描述，现已成为描述应用重组病毒克制内源基因体现的专门词汇3。最早的VIGS体系采用的
3、病毒载体是典型的RNA病毒。1995年，Kumagai等人4在烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)上插入了一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS) cDNA片段，当TMV重组病毒侵染烟草后，侵染植物的叶片变成白色，研究表白被感染植株产生的白化效应是由于PDS mRNA水平明显减少引起的。PDS是类胡萝卜素合成途径中的一种核心酶，而类胡萝卜素在植物中具有光保护的作用，类胡萝卜素合成途径被阻断导致植物光保护功能的丧失，从而引起白化效应。1998年，Baulcombe研究组5在马铃薯X病毒(Potato X virus，PVX)基因组上同样
4、插入了一段PDS cDNA，重组病毒侵染植物后也浮现了失去光保护作用的白化效应,由此她们提出VIGS可以有效地克制植物内源基因的体现,从而可以运用病毒载体进行未知基因的功能鉴定。，Baulcombe研究组6又报道了以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)为载体的VIGS体系，发现无论在克制转基因还是内源基因的体现上，TRV载体诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX载体，TRV自身产生的症状也轻于PVX。目前，TRV病毒载体已在番茄(Solanum lycopersicum)、烟草(Nicotinaspp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、辣椒(Capsic
5、um spp.)、拟南芥和棉花(Gossypium spp.)等多种植物上被广泛应用。1998年, Robertson研究组6运用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus, TGMV)初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默来研究植物基因组功能的体系。运用TGMV的DNA-A为载体在本氏烟上先后成功诱导了镁离子螯合酶的核心基因Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因(luc)发生沉默，从而在叶片上浮现黄色突变表型和转luc基因植株不再发出荧光。随后,非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)和棉花皱缩病毒(Cott
6、on leaf crumple virus, CLCrV )载体相继在木薯和棉花中得到成功应用, 这也许将极大地增进木薯和棉花的功能基因研究7,8。继RNA病毒和DNA病毒作为载体的VIGS体系之后，Gossele等人9又发展了一种基于卫星病毒的VIGS体系, 她们对随着TMVU2的卫星病毒(STMV)基因组进行了改造,使其具有插入外源片段的能力，通过在烟草上对PDS等13个植物内源基因的测试成果表白，STMV载体可以有效克制这些基因的体现并呈现明显的表型突变。由于卫星病毒的基因组具有在植物中复制水平高以及自身基因组小，且在实验中容易操作等特点，使其成为一种优良的候选沉默载体。2 VIGS的作
7、用机制基因沉默在生物中普遍存在，其作用表目前抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵，辨认并克制外源基因体现，维持生物基因组稳定性等（Baulcombe，）。VIGS作为基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后，在复制与体现过程中一般会形成双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA）形式的中间体。dsRNA作为基因沉默核心激发子，一方面在细胞中被类似RNase 家族特异性核酸内切酶Dicer类似物（如DCL4）切割成21 24 nt的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）（Llave，）。siR
8、NAs 在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2 或RDR6进一步扩增（Donaire et al.，），并以单链形式与Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC 特异地与细胞质中的同源RNA互作，导致同源RNA降解，从而发生转录后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）（Brodersen et al.，；Qu & Morris，；Llave，
9、）；RISC 特异地与细胞核内同源DNA互相作用导致其被甲基化等修饰，从而发生转录水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）（Zheng et al.；Llave，）。3 VIGS类型3.1RNA病毒诱导的基因沉默RNA病毒诱导的基因沉默是目前研究比较进一步的一种基因沉默。，Ratcliff et al 10 报道了以烟草脆裂病毒( Tobacco rattle virus, TRV)为载体的V IGS体系，并比较了TRV和PVX诱导转基因GFP、转基因GUS、内源基因PDS、Rubisco小亚基和LEAFY开花基因发生基因沉默的效率和持续时间，研究
10、发现无论在克制转基因还是内源基因的体现上，TRV诱导基因沉默的效率和持续性都优于PVX，同步，TRV产生的病毒症状也轻于PVX。，Holzberg et al 11 以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)为载体，初次在单子叶植物大麦上成功克制了PDS基因的体现。，又报道了以豌豆早枯病毒( Pea early browning virus，PEBV)为载体的V IGS体系，这是第1个可应用于豆科植物基因沉默的V IGS载体12。其中，TRV是应用最广的VIGS载体，被应用于本氏烟、番茄、拟南芥和马铃薯等多种植物。该载体目前有3个版本，即最早由Rat
11、cliff et al构建的版本、Liu et al13改善的版本pYL156和pYL279，以及Valen2tine et al14的TRV22b版本。其中，Liu et al的版本插入了双倍CaMV35S启动子，在C端插入了1个核酶，可导致更有效的病毒RNA的产生；而TRV22b与前2个版本的区别在于TRV22b保存了TRV RNA2中的2b基因序列。不同版本的TRV载体在合用植物范畴以及可沉默植物组织等方面有明显区别。Ratcliff et al的版本目前只用于本氏烟(Nicotiana benthamiana)和茄属(Solanum )的3个种；而pYL156则除了应用在本氏烟和茄属的
12、2个种外；还合用于番茄、烟草、辣椒等作物，但不能诱发马铃薯栽培品种卡拉产生有效的基因沉默15。而TRV22b则导致植物根部和顶端分生组织中产生比上述2种TRV更好的基因沉默效果。3.2其他病毒诱导的基因沉默与上述RNA病毒类似, DNA病毒也能诱导基因沉默。1998年，北卡罗那州立大学Robertson研究组16运用双生病毒科的番茄金花叶病毒( Tomato golden mosaic virus, TGMV) DNA2A为载体，在本氏烟上成功诱导了镁离子螯合酶核心基因Su ( Sulfur)和转基因luc荧光蛋白基因沉默，从而初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默研究植物病毒功能的体系。但是T
13、GMV DNA2A载体诱导基因沉默后的效率比较低，并且病毒自身会产生严重的病毒症状。因此在，Robertson研究组17又报道了以TGMV DNA2B为载体的VIGS体系，该载体在基因沉默效率和持久性上都比DNA2A强，在植株中产生的病毒症状也有所减轻。，Turnage et al18运用甘蓝曲叶病毒(Cabbage leaf curl virus, CbLCV)在拟南芥上成功建立了VIGS体系。非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)也是近来报道的VIGS载体。上述3种均为单链环形DNA病毒,由DNA2A和DNA2B 2种组分构成，已分别被应用
14、于本氏烟、拟南芥和木薯的基因沉默研究19。与RNA病毒类V IGS载体相比， DNA病毒类VIGS载体的长处是侵染性克隆构建简朴，无需转录，稳定，易于操作，但基因沉默效果不如RNA病毒类VIGS载体。以RNA病毒和DNA病毒为载体的VIGS体系建立后，Gossele et al20对TMVU2的卫星病毒(Tobacco mosaic satellite virus, TMSV)基因组进行改造，使其具有插入外源片段的能力，从而建立了一种基于卫星病毒的V IGS体系。该体系能有效地克制烟草PDS等13个植物内源基因的体现并呈现明显的突变表型。，陶小荣等21在对中国番茄黄曲叶病毒( Tomato y
15、ellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的研究中，分离和鉴定了一种新型的DNA卫星分子(DNA)，并对DNA上的C1基因进行了缺失和引入多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)，将其改导致为一种DNA卫星载体。该载体可以有效地克制转基因GFP的体现，也可以高效地克制内源基因PDS和Su的体现，可应用于多种茄科植物的VIGS分析21 - 24 。同步，该载体自身基因组小，载体构建操作相对容易，且对高温不敏感，非常合用于维管束组织特异性体现基因的VIGS分析 23, 24 。4 VIGS有关的实验措施4.1 VIGS环境条件的控制成功的
16、基因沉默依赖于病毒在植物体内的传播和植物生长之间的互相作用，而这2个方面都受到环境条件的影响(Burch-Smith等)。对于病毒的传播和有效的沉默，温度是最重要的影响因子之一。而对于不同的植物，有效沉默所需要的温度也也许不同。例如，用TRV 感染番茄，较好的沉默表型在22 或更低的温度下发生；而用TRV感染烟草，合适的温度则在25 左右(Burch-Smith等；Ekengren等；Liu等a；Nethra 等)。目前的研究证明，植物培养室(growth chamber)是进行VIGS 实验较为抱负的选择，而控温较差和温度波动大的温室不合适于做VIGS实验。此外，Fu等()发现，低温和低湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持续时间。4.2 设计合理的实验对照对于每个VIGS实验，都必须要有合适的对照来监控沉默的效果。阳性对照一般采用八氢番茄红素脱氢酶( phytoene desat
