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1、 RPHPLC法测定散瘀软膏中盐酸小檗碱的含量 作者：尹华 章建华 周爱珍 许丛辉 作者单位：1.浙江中医药大学药学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学第一附属医院 【摘要】目的建立散瘀软膏中盐酸小檗碱的HPLC含量测定方法。方法采用反相离子对高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C8 （4.6150mm，5m）；流动相：乙腈0.1 %磷酸溶液=5050（每100 mL流动相加入十二烷基硫酸钠0.1 g）；检测波长：265 nm；流速：1.0 mLmin-1；室温：20 ；进样量：20L。结果盐酸小檗碱在39.40394.0 ng的范围内线性关系良
2、好，回归方程为：Y=4.073103x2.248103（r=0.9992）；加样回收率在97.9100.9 %，平均回收率为99.4 %，RSD为1.5 %。结论所采用的定量方法简便、可靠，结果准确，重复性良好，可用于散瘀软膏的质量控制。 【关键词】 散瘀软膏；盐酸小檗碱；反相高效液相色谱法；含量测定 Determination of Berberine Hydrochloride in San Yu Ointment by HPLC Yin Hua，Zhang Jianghua，Zou Aizhen，et al 1.College of Pharmacy，Zhejiang Chinese M
3、edicine University，Hangzhou(310053)，China 2.Zhejiang Medical University First Affiliated Hospital Abstract：Objective To establish a content determination method of Berberine hydrochloride in San Yu Ointment by HPLC.Methods RPHPLC was performed to determine Berberine hydrochloride on a column of Agil
4、ent Zorbax Eclipse XDBC8（4.6150mm，5m）at 20; Acetonitrile-0.1 % H3PO4 （5050）（Adding 0.1 g C12H25NaO4S to every 100 mL）was used as mobile phase，the flow rate was 1.0 mLmin-1.The detection wavelength was at 265 nm.ResultsA good linearity can be found in the range of 39.40 394.0 ng，and the regression eq
5、uation was Y = 4.073103x2.248 103 （r=0.9992）.The recovery was between 97.9 %100.9 %，and the average recovery rate was 99.4 %，RSD was 1.5 %.ConclusionThe method is simple，rapid，accurate and available，which can be used to control the quality of San Yu Ointment. Key words：San Yu Ointment; berberine hyd
6、rochloride; RPHPLC; quantitative determination 散瘀软膏是以浙江省中医院的医院制剂散瘀膏为基础，由大黄、黄芩、黄柏、玄明粉加乳剂型基质制成的水包油型（O/W）乳膏剂，属局部外用药膏，具有活血化瘀，消肿止痛的作用。12为保证临床用药疗效稳定、安全可靠，及各批产品间质量的稳定可控，我们建立了反相离子对高效液相色谱法测定散瘀软膏中盐酸小檗碱的含量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司）；PL5124型纯水机；S Sartorius BD211D 电子天平（德国塞多利斯 十万分之一）；a
7、rtorius BS110S 电子天平（德国塞多利斯 万分之一）； KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；PHS3TC（0.01级）精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司）。 1.2 试药 盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110713200208）；乙腈（色谱纯，Merck）；水为过0.2m滤膜的纯水；十二烷基硫酸钠位离子对试剂；甲醇、乙醇、磷酸等其余试剂均为分析纯；散瘀软膏及缺黄柏的阴性制剂由浙江中医药大学中药标准化研究实验室制备，批号：20071019、20071102、20071
8、125。 2 方法和结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C8（4.6150mm，5m）；流动相：乙腈0.1磷酸溶液=5050（每100ml流动相加入十二烷基硫酸钠0.1g）；检测波长：265nm；流速：1.0 mlmin-1；室温：20；进样量：20l；理论塔板数以盐酸小檗碱峰计不低于4000。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.985 mg的溶液；精密量取上述对照品溶液0.40 ml置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得盐酸小檗碱浓度为39.40gml-1的对照
9、品储备液；再精密量取该储备液2.0 ml置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为7.88gml-1的盐酸小檗碱对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备 取散瘀软膏制剂1.5 g，精密称定，加入60 %乙醇溶液20 ml，回流30min，放冷，转移至冰水浴中放置5min，过滤，用少量60 %乙醇溶液多次洗涤滤纸和滤器，合并滤液和洗液置50 ml棕色量瓶中，加60 %乙醇溶液稀释至刻度，密塞，摇匀。精密量取上述溶液1 ml，蒸干，残渣用流动相溶解并稀释至10 ml，过0.45m滤膜，取续滤液，即得。 2.2.3 缺黄柏阴性对照溶液的制备 按处方比例称得除黄柏的其他药味，按散瘀软膏的制备
10、方法制成缺黄柏的阴性制剂，再按“2.2.2供试品溶液的制备”项下的方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。 2.3 空白试验 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏的阴性对照溶液各20l，在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图。盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏阴性对照溶液色谱图如图1A、B、C所示，散瘀软膏供试品色谱图中，在与盐酸小檗碱对照品色谱图相同保留时间处，有相应的色谱峰；而缺黄柏的阴性对照溶液在此保留时间处无相应的色谱峰，说明散瘀软膏制剂中其他药味对盐酸小檗碱的测定不产生干扰。 2.4 线性关系考察 精密吸取浓度为39.40gml-1的盐酸小檗碱对照品储备液各0.1 ml、0.2
11、 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0 ml置2 ml棕色量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度，得5个浓度系列的对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样20l，测定，以盐酸小檗碱对照品溶液的进样量（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y = 4.073103x2.248103（r=0.9992），表明盐酸小檗碱在39.40 ng394.0 ng 范围内具有良好的线性关系。 2.5 精密度试验 精密吸取浓度为7.88gml-1的盐酸小檗碱对照品溶液20l，在上述色谱条件下连续重复进样6次；取上述对照品溶液在第1、2、3、4、5天分别进样，结果盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度峰面积的RSD为1.
12、3 %，日间精密度峰面积的RSD为1.3 %，表明盐酸小檗碱对照品溶液日内精密度和日间精密度均符合要求。 2.6 稳定性试验 取散瘀软膏制剂（批号：20071019）1.5 g，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进样20l，在上述色谱条件下进样测定，盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.8 %，表明供试品溶液中盐酸小檗碱在48 h内稳定。 2.7 重复性试验 取同一批号散瘀软膏制剂（批号：20071019）5份，每份1.5 g，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，结果制
13、剂中盐酸小檗碱的平均含量为3.546 mgg-1，RSD为0.4 %，表明重复性良好。 2.8 加样回收率试验 取已测含量的散瘀软膏制剂（批号20071019）5份，每份0.75 g，分别精密加入浓度为1.106 mgml-1的盐酸小檗碱对照品溶液2.5 ml，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法处理，在上述色谱条件下进样20l，测定，结果盐酸小檗碱的加样回收率在97.9 %100.9 %之间，平均加样回收率为99.4 %，RSD为1.5 %，符合要求。见表1。表1 加样回收率试验结果 （略） 2.9 样品测定 取3个批号的散瘀软膏制剂（批号：20071019，20071102，20071
14、125），每批各2份，每份1.5g，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20l，采用外标二点法测定，计算制剂中盐酸小檗碱的含量，结果见表2。表2 样品测定结果（略） 3 分析与讨论 3.1 基质去除方法的考察 中药制剂含量测定是否准确关键在于前处理工艺的合理性，既要尽可能完全地提取相应的被测成分，又要尽可能的减少测定干扰。而散瘀软膏为（O/W）型乳膏剂，含有硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林、羊毛脂等油性基质，不仅会干扰指标成分的测定，同时也会对色谱柱造成损伤，因此，去除基质的干扰显得尤为重要。在实验中，我们结合盐酸小檗碱的理化性质，考
15、虑硬脂酸（溶于乙醚、氯仿、丙酮，不溶于水）、单硬脂酸甘油酯（溶于乙醚、氯仿、异丙醇等，不溶于水）、液体石蜡（溶于乙醚、氯仿，不溶于水或醇）、白凡士林（溶于乙醚或汽油中，几乎不溶于乙醇或水）、羊毛脂（溶于乙醚、氯仿、丙酮，不溶于水、微溶于冷乙醇）等基质的溶解性3，考察常用的油性基质去除方法：有机溶剂（氯仿、乙醚）萃取法，冰水浴法。结果发现：样品用蒸馏水溶解后，以氯仿萃取，由于氯仿的密度比水大，处于下层，而油性基质的密度相对比水小，仍有油滴浮于水层上，基质去除不完全；样品用蒸馏水溶解后，用乙醚萃取，乙醚的密度虽然比水小，但其沸点较低，萃取时乙醚蒸汽易喷出，影响含量测定的准确性，尤其是在夏天，温度较高，影响更为明显；样品用60%乙醇溶液回流提取后，放冷，置冰水浴中，滤过以去除基质，效果较为理想。以60%乙醇溶液作为提取溶剂，与散瘀软膏提取工艺研究中的药材提取溶剂一致，有助于盐酸小檗碱的提取完全；同时通过在冰水浴中放置，促进各油性基质的凝固，
