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1、第5章 培养基灭菌和空气除菌教研室：生物工程 教师姓名： 余有贵课程名称发酵工艺学授课专业及班次09级食品科学与工程方向授课内容培养基灭菌和空气除菌授课方式及学时讲授与自学、8H目的要求掌握工业用培养基湿热灭菌的原理和方法、不同空气除菌流程的特点，熟悉发酵工业对无菌空气质量的要求和介质除菌过滤的机理，了解空气过滤器的特性。重点与难点（1）教学重点：培养基的湿热灭菌、空气的介质过滤除菌（2）教学难点：培养基连续灭菌与空气的介质过滤除菌的流程选择讲授内容及时间分配（1）灭菌的意义和方法（2）培养基的湿热灭菌（3）空气的除菌（4）无菌检测及发酵废气废物的安全处理参考资料（1）田洪涛.现代发酵工艺原理
2、与技术.化学工业出版社,2007（2）余龙江.发酵工程原理与技术应用.化学工业出版社,2006（3）俞俊棠,唐孝宣等.新编生物工艺学.化学工业出版社,2003（4）姚汝华主编.微生物工程工艺原理(第二版).广州:华南理工大学出版社,2005教学过程一、灭菌的意义和方法1、灭菌的意义采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。保证纯种发酵，防止杂菌和噬菌体污染。消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。2、灭菌的方法（1）火焰灭菌：接种时使用, 灼烧是一种最彻底的
3、干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌（2）干热灭菌法：适于灭菌后要求保持干燥状态的物料，将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12小时后，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。（3）湿热灭菌法：多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。工业生产上广泛使用，常用120，20-30min。（4）射线灭菌法：适于表面灭菌，紫外线波长在2600埃左右灭菌效力
4、最强，一般用30瓦紫外灯照射20-30min（5）化学药剂灭菌：1）0.1%-0.25%的高锰酸钾溶液:皮肤消毒2）2%-5%漂白粉:用具和车间环境的灭菌3）70%-75%酒精溶液:皮肤和玻璃器皿表面灭菌4）0.25%新洁尔灭: 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌5）0.5%甲醛:用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌，10ml/m3,6-12h（6）高压静电灭菌：应用于空气的灭菌(7）介质过滤除菌：滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。二、培养基和设备的湿热灭菌1、湿热灭菌的原理1.1概念致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：微生物在某一特定的
5、条件下的致死时间性，表示微生物对热的抵抗力。1.2原理湿热灭菌的基本原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是：既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营养成分的破坏。1.3微生物的热死规律-对数残留定律对数残留定律：微生物的死亡速率dN/d与任何一瞬间残存的活菌数成正比,即dN/d=KN式中：N-活菌数（个ml） -受热时间（S）k-比死亡速率（S-1），与微生物种类和加热时间有关在恒温下，当=0,N=N0时，可得：理论灭菌时间 =
6、(2.303/k)log(No/Ns) - -灭菌时间（秒） k-比死亡速率，与菌的种类和加热温度有关（s） No-灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个ml） Ns-经过灭菌时间后，残存活菌个数（个ml） 1）杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。 2）从上式可知：要做到绝对无菌，即N=0，则时间将无限大。故在实际计算中取N=10-3，即每处理1000批中只残留一个活菌数，该值在工程上已足够了。1.4 灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系k=Ae-E/RT 式中：K菌死亡的速度常数
7、（s），当反应物的浓度为单位浓度时，则反应速度常数在数值上等于反应速度 E活化能，J/molA阿累尼乌斯常数（s） R气体常数（8.314Jmol.K） T绝对温度（K） 1.5培养基成分受热破坏规律（看作一级反应）-dc/dt=kdc 式中：C为对热敏性物质的浓度；kd为分解速率常数（s），1.6高温快速灭菌法优于低温长时间灭菌法：当灭菌温度升高时，菌的比死亡速率增加较培养基成分分解速率常数快，因而在较高的温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。2、影响培养基灭菌的因素（1）培养基中的颗粒与物理状态 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，
8、但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响，固体培养基的灭落时间要比液体培养基的灭菌时间长，假如lOO时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热的传递除了传导作用外还有对流作用，而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，另外液体培养基牛水的传热系数要比有机固体物质大得多。（2）培养基中的微生物数量 不同成分的培养基其含菌量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含
9、菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。（3）培养基成分 油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。如大肠杆菌在水中加热至6065便死亡，在10 %的糖液中，需70处理46 min，而在30的糖液中则需70处理30min. 低浓度(12)的NaCI溶液对微生物有保护作用，但随着浓度的增加，保护作用减弱，浓度达810以上，则减弱微生物的耐热性。（4）培养基pH pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0 8.0时微生物最不
10、易死亡， pH 6.0时,氢离子易渗入微生物的细胞内,改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。表5-1 pH对灭菌时间的影响 温度孢子数(个毫升)灭菌时间minpH 6.1pH 5.3pH 6.5pH 4.7pH 4.5 120 115 110 105 10000 10000 10000 100008257034072565720512351803303015031324150（5）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利。因此对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。3、消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培
11、养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112即0.57kgcm2或8磅英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌4、培养基灭菌方式4.1分批灭菌1）概念：将配制好的培养基置于发酵罐中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭菌的操作过程，叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。包括：加热、维持和冷却三个阶段。2) 操作要点三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热
12、，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。 开始灭菌时，应排放夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，夹套内通入蒸汽。当发酵罐的温度升至70时，开始由空气过滤器、取样管和放料管通人蒸汽，当发酵罐内温度达到120，压力达到l105Pa(表压)时，灭菌进入保温阶段。在保温阶段，凡液面以下各管 道都应通蒸汽，液面以上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定直到保温 结束。再依次关闭各排气、进气阀门，并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气，维持发酵罐降温过程中的正压，且在夹套或蛇管中通入冷却水，使培养基的温度降到所需温度。4.2 连续灭菌（1）空罐灭菌 空罐灭菌也称空消。无论
13、是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。 （2）培养基连续灭菌1）概念：将配制好的培养基在通入发酵罐之前，进行加热、保温和降温的灭菌过程，叫做连消。2）优点：连续灭菌可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小。组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌，以减少物料至受热破坏的程度，也可将糖和
14、氮源分开灭菌，以免醛基与氨基受热发生反应生成有害物质。3）流程A、喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程是常用的连续灭菌流程(见图51)。培养基由配料罐放出，通过蒸汽预加热后，用连消泵送入气液混合器或连消塔底端，料液被加热到灭菌温度(130)后，由顶部流出，进入维持罐，维持825min，再由维持罐上部侧面管道流出，维持罐内最后的培养液由底部排尽，经喷淋冷却器冷却到发酵温度，送入发酵罐。图5-1 喷淋冷却连续灭菌流程 B、喷射加热连续灭菌流程图5-2 喷射加热连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程也是常用的连续灭菌流程(见图52)。蒸汽直接喷人培养基，因此培养基急速升温到预定的灭菌温度，在此温度下的保温时问由维持段管子的长度来保证，灭菌后培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器，急速冷却。该流程由于受热时间短，故温度可升到140而不会引起培养基的严重破坏。该流程能保证培养基先进先出，避免过热或灭菌不彻底的现象。C、薄板式换热器连续灭菌流程图5-3 薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程是较为节能的流程(图53)。该流程采用了薄板换热器作为培养基的加热器和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养基的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。虽
