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1、 北京家禽育种有限公司保健中心作业指导书 受控 文件编号:BPBC-QD-HC04 第 1 页 共 37 页 保健中心检验程序血清学一血清平板凝集试验细菌等颗粒性抗原的悬液与相应的抗体结合后,在电解质的参与下，抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象叫做凝集反应。操作程序：在洁净的白瓷反应板(或玻璃板)上，滴加待检血清一滴(约30ul)，然后加一滴(约30ul)抗原于血清中，使其充分混合，轻轻摇动平板2分钟，判定结果。如在2分钟内出现明显的凝集块，背景清亮即可判为阳性；介于二者之间判为可疑。同时，阴阳性对照应分别呈阴阳性结果。本试验应在22以上的环境中进行，每次进行反应时应有阳性血清和抗原对照。使用
2、前将抗原和血清从冰箱取出，待其温度接近室温时再做试验。使用前将抗原充分摇匀，每次检测时作阳性、阴性血清及盐水对照。并检测一下抗原是否有自凝现象，如抗原污染细菌或霉菌，出现自凝颗粒或霉团时应废弃。如抗原一次使用不完，剩余部分应放回冰箱保存。附：全血平板凝集反应操作方法：在洁净的白瓷板或玻璃板上，滴上鸡白痢-鸡伤寒抗原一滴(约0.05毫升），立即用针头刺破鸡肱静脉，用取血环(内径7.5-8.0毫米金属丝环)取2满环血(约0.05毫升)加入抗原中，充分混匀，轻轻摇动。一般在20秒钟内出现反应，2分钟判定结果。二免疫扩散试验免疫扩散试验又称琼脂凝胶扩散试验(AGP)。其原理是抗原抗体在含有电解质的琼脂
3、凝胶中可以向四周自由扩散，当抗原、抗体扩散至适当部位相遇时，则出现肉眼可见的沉淀线，这是抗原抗体的特异性结合物，可以用此试验测定未知的抗体或抗原。免疫扩散试验可诊：鸡传染性法氏囊病，鸡传染性支气管炎，鸡马立克氏病，禽脑脊髓炎，鸡病毒性关节炎，禽流感，鸡痘，禽霍乱，鸡传染性鼻炎，禽白血病，鸡传染性喉气管炎。在免疫扩散试验中，虽然琼脂平板的制备随诊断的疾病而异,但其操作方法基本相同。大体有三种，即：PBS，0.8%PBS，BBS。琼脂平板由供应室制备。在试验前，将抗原及阳性血清按稀释的要求配制。从冰箱取出备用的琼脂板，用外径为4毫米的打孔器按六角形图案打孔，中心孔与周围孔的孔距为3毫米。将孔中的琼
4、脂用6-8号针头轻轻向上挑出即可。在酒精灯上稍加热，蒸发其表面水分，即封底，目的是防止琼脂与平皿底脱离。然后作好标记，准备加样品。中心孔滴加抗原，1、4孔加入阳性血清。2、3、5、6孔各加入待检血清（抗原和待检血清各孔加约30微升，每加一份血清更换一个滴头。）加至孔满为止，但不要溢出。待孔中液体吸干后，将平皿倒置，放入37温箱中，保持一定的湿度，经 24-48小时后，在8瓦日光灯下观察结果。判定：1阳性：标准阳性血清与抗原之间有明显致密的沉淀线时，受检血清与抗原之间也形成沉淀线或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。2阴性：受检血清与抗原之间不形成沉淀线或者阳
5、性血清的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或其向外侧偏弯者，此受检血清判为阴性。三红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）的操作程序（一） 鸡新城疫（ND）的HA 和HI试验1试验准备1-1抗原：从中监所或哈兽研买的已知抗原。1-21%红细胞悬液的配制由鸡翅静脉或心脏采血，放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份），混匀。将此血液注入离心管中，经2000转/分钟，离心5分钟，用吸管吸去上清夜和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加0.9% 生理盐水洗涤；再经2000转/分钟，离心5分钟，弃去上清夜，加0.9% 生理盐水洗涤。如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按1% 的稀释度加
6、入生理盐水（1毫升红细胞泥加99毫升0.9% 的生理盐水）。1-3 被检血清：由鸡场送来的装有全血的采血管，经10000转/分钟，离心5分钟，待血清析出后使用。1-40.9%生理盐水：由供应室提供。1-5红细胞保存液：由供应室提供。2红细胞凝集试验（HA）HA试验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用的病毒稀释倍数（抗原单位）。本试验采用96孔V型微孔塑料板，可同时测8个样品。2-1 用12头移液器向每个孔中加入0.9%生理盐水0.05毫升。 2-1用单头移液器吸取0.05毫升待测病毒抗原液加入第一孔中，进行反复稀释（此时应注意不要产生气泡），一般挤压5次即可，使病毒液与生
7、理盐水充分混匀，再吸出0.05毫升加入第二孔中，如此连续稀释至第11孔，病毒稀释倍数依次为1:2-1:2048，最后从第11孔中取出0.05毫升弃去。第12孔做红细胞对照孔。每次至少重复测4排病毒液，以消除偶然误差。2-2 用12头移液器每孔各加入1%红细胞悬液0.05毫升。2-3在微型震荡器上震荡，混匀约1-2分钟，再静置。在18-22室温下作用40分钟后观察结果。如下图：孔号123456789101112病毒稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048红细胞对照孔稀释液（m）0.050.050.050.050.050.050.05
8、0.050.050.050.050.05病毒液（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.05ml1%红细胞（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05判定（例） +-注：+表示完全凝集，+表示不完全凝集，-表示不凝集。3- 每次测定样品都应做红细胞对照。结果观察：将反应板竖立于桌上，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线形流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞已被病毒所凝集。如上例，病毒液HA效价为
9、1:256，在HI试验时，病毒抗原液0.05 ml内须含4个凝集单位，则应将病毒液 作成256/4=64倍的稀释液。4红细胞凝集抑制试验（HI）新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制。因此，可用HI试验测定鸡血清中的HI抗体效价（滴度）。本试验同样采用96孔V型塑料板。4-1 用12头移液器向每个孔加入生理盐水0.05毫升。4-2 用单头移液器吸取待检血清 0.05毫升加入第一孔中，反复挤压5次，使稀释液与血清混匀，再吸出0.05毫升加入第二孔中，如此连续稀释至第12孔，最后弃去0.05毫升。4-3 用12头移液器吸取上述HA试验中4单位病毒液，于每孔中各加入0.05毫升。4-4 置于
10、震荡器上混匀1-2分钟，再在18-22室温下静置20分钟。4-5 用12头移液器吸取1%红细胞悬浮液，各孔加入中0.05毫升。4-6 置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在18-22室温下作用40分钟后观察结果。如下图：孔号123456789101112被检血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048红细胞对照孔稀释液（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05被检血清（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.05
11、ml病毒液(ml)（4单位）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.051%红细胞（ml）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05判定（例）-+注：+表示完全凝集，+表示不完全凝集，-表示不凝集。4-7 结果判定：将反应板竖立于桌上，沉于管底的红细胞沿着斜面向下呈线状流动者，表示血清中含有足量能抑制病毒液凝集红细胞的抗体；若孔底的红细胞呈现边缘不齐的分散状态，表示血清中的抗体量不足以完全抑制病毒凝集红细胞的作用，或者表示血清中无特异性抗体。 能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血
12、清最高稀释度倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用以2为底数的对数（Log2）表示。上表HI效价为8（Log2）。（二） .鸡减蛋综合症（EDS-76）的HA和HI 试验鸡减蛋综合症（EDS-76）的HA和HI 试验的操作步骤同于鸡新城疫的HA和HI 试验，只是鸡减蛋综合症的HI试验中加入1%红细胞悬浮液，震荡混匀后，在18-22下作用30分钟后观察结果。（三） 鸡毒支原体（MG）的HA和HI 试验1红细胞凝集试验（HA）操作步骤同于ND的（HA）试验，用量也相同。2红细胞凝集抑制试验（HI）2-1用移液器向第1孔中加生理盐水0.09ml，第2孔至第12孔每孔加生理盐水0.05ml。2-2用
13、单头移液器吸取待检血清0.01ml加入第1孔中，反复挤压稀释5次，吸出0.05ml加入第2孔中，如此连续稀释至第六孔，血清稀释倍数依次为1:10-1:320，最后从第六孔中吸出0.05ml弃去。2-3 用12头移液器向各孔加HA试验中的4单位病毒液0.05ml。2-4置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在室温18-22静置20分钟。2-5用12头移液器吸取1%红细胞悬浮液0.05ml加入各孔中。2-6置于震荡器上震荡混匀1-2分钟，在室温18-22静置40分钟后观察结果。2-7结果判定：血清HI抗体效价 80的为阳性。（四） 滑液囊支原体（MS）的HA和HI试验 操作步骤及用量和判定结果全同于鸡毒支原体的HA和HI 试验。（五） 传染性支气管炎（IB）的HA和HI 试验操作步骤及用量同于鸡新城疫的HA和HI 试验，只是在试验中所用的红细胞悬液的浓度为0.75%。（六） 检测血清的禽淋巴白血病ELISA实验程序准备：所
