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1、VE对去卵巢大鼠血清TSOD、GSHPX活力与心肌细胞凋亡的影响作者：李政媛,张婷婷,陈宇豪,国智超,张翔,赵单位：吉林医药学院，吉林 吉林【摘要】 目的 以去卵巢大鼠为更年期动物模型,观察心肌细胞抗氧化能力与凋亡的变化，探讨维生素E（VE）对老年心肌细胞凋亡的影响机制。方法 以正常成年大鼠（假手术组）和去卵巢大鼠（老年对照组）为对照，实验组大鼠腹腔注射VE：5 mg/kg（小剂量组)、15 mg/kg（大剂量组)，连续注射9周。采用比色法测血清中总超氧化物歧化酶(TSOD)与心肌组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活力，Hoechst染色法检测细胞凋亡。结果 实验组大鼠血清TSOD与心
2、肌GSHPX活力高于去卵巢大鼠，低于假手术组；大剂量组TSOD与GSHPX活力高于小剂量组；Hoechst荧光染色显示，VE大剂量组大鼠心肌细胞凋亡明显少于小剂量组，但多于假手术组，小剂量组心肌细胞凋亡与去卵巢组相似。结论 大剂量VE可提高心肌抗氧化能力，减少心肌细胞的凋亡，延缓围绝经期妇女心肌细胞的衰老。 【关键词】 维生素E 总超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶维生素E（VE）是具有抗氧化作用的维生素，其结构与雌激素相似，可通过抑制自由氧对细胞的氧化而起到保护细胞、延缓衰老的作用。VE对生殖系统的功能维持也具有重要作用，研究表明1，对于自然衰老雌性大鼠，VE通过抗氧化、抗自由基作用，可延缓
3、卵巢细胞的衰老，提高血清雌激素水平，通过雌激素受体表达的上调，增加抗氧化酶的表达来起到减少心肌细胞凋亡的作用。但在体情况下，VE单独作用对减少心肌细胞凋亡的作用并未进行揭示。本研究用去卵巢大鼠为衰老动物模型，给予不同剂量的VE，观察VE对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响，进一步探讨VE对心肌细胞凋亡影响的机制。 1 材料与方法 1.1 模型制备与处理 Wistar成年雌性大鼠32只，10月龄,体重(230±20)g，购于吉林大学白求恩医学部实验动物中心。随机分成4组：正常对照组（假手术组）、去卵巢对照组（老年组）、去卵巢小剂量VE组、去卵巢大剂量VE组。大鼠适应1周后，腹腔注射1%戊巴
4、比妥钠(30 mg/kg)麻醉,固定,背部切口去双侧卵巢，假手术组切除一小块脂肪,分层缝合。去卵巢1周后,阴道涂片,已无性周期变化。对照组大鼠腹腔注射植物油,实验组大鼠按5 mg/kg和15 mg/kg腹腔注射VE,每日1次,持续9周。 1.2 实验材料 VE注射液购于上海通用药业股份有限公司；植物油为食用色拉油；总超氧化物歧化酶(TSOD)、心肌谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活力及Hoechst凋亡试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。 1.3 生化指标的测定 大鼠摘眼球取血，4冰箱静置过夜，3 000 r/min离心10 min，取上清液，-20冰箱保存待测。血清TSOD活力采用黄嘌呤酶法
5、。以铜锌SOD(CuZnSOD)与锰SOD（MnSOD）相加为TSOD。每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位。测定时每份血清样品取20 μl，按试剂盒说明书操作，结果以活力单位/毫升（U/ml）表示。 取心肌组织匀浆后离心取上清液，稀释至2%，取样品0.2 ml测GSHPX活力。规定为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，是反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位，结果以活力单位/毫克蛋白（U/mg pro）表示。 1.4 Hoechst检测细胞凋亡 剪下心脏，主动脉逆行插管，用100 ml预冷的生理盐水(4)灌注心脏后，换以40 g
6、/L多聚甲醛灌注固定1 h，然后置入同浓度多聚甲醛溶液中浸泡固定10 h，常规石蜡包埋及组织切片，片厚5 μm，常规脱蜡处理后进行Hoechst33258染色，荧光显微镜观察拍片。 1.5 统计方法 实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.0统计软件包，进行组间t检验。 2 结 果 2.1 TSOD活力、GSHPX活力比较 各组血清TSOD活力、心肌匀浆GSHPX活力比较见表1。表1可见，老年对照组TSOD、GSHPX活力明显低于假手术组（P<0.01）；实验组大鼠的TSOD、GSHPX活力明显低于假手术组（小剂量组P<0.01，大
7、剂量组P<0.05），实验组大鼠与老年对照组相比TSOD、GSHPX活力虽有所增加，但无显著性差异，大剂量组TSOD、GSHPX高于小剂量组，亦无显著性差异。 2.2 HoechstPI染色法检测细胞凋亡 大鼠心肌细胞凋亡情况如图1，蓝色荧光表示发生凋亡的心肌细胞，荧光强表示凋亡程度重。由图1可见，假手术组只有少数荧光，细胞凋亡少；大剂量组染色较多，细胞凋亡比假手术明显增多；小剂量组与表1 大鼠TSOD和GSHPX活力比较与假手术组比较，*P<0.05，*P<0.01； 3 讨 论 女性进入老年期后，随着机体衰老，活性氧生成增加，而清除能力下降，氧自由基攻击生物膜，使膜不饱和
8、脂肪酸发生脂质过氧化2。在生物体内清除活性氧的体系主要包括：SOD、GSHPX、其它抗氧化酶及谷胱甘肽、生育酚等抗氧化剂。SOD是生物体内最为重要的抗氧化酶之一，能特异清除超氧阴离子，但研究发现，该酶可与H2O2形成复合物(SODH2O2)而失活2。GSHPX可分解细胞液中形成的过氧化物，防止羟自由基和单线态氧的生成，减少自由基的积累。二者在体内的水平可一定程度上代表体内的抗氧化能力的变化。这可以在赵红等3的研究中得到证明。 在我们的实验中观察到：TSOD、GSHPX的活力在实验组虽高于老年对照组，但并没有显著的差异，而假手术组明显高于其它各组。说明：VE可提高老年心肌抗氧化能力，但作用有限，
9、其主要抗氧化作用是通过增加体内雌激素水平，通过雌激素途径发挥的。 心肌细胞的凋亡情况也表明，小剂量VE在单独作用时，虽可小幅度的提高机体的抗氧化能力，但并没有抑制心肌凋亡的作用；大剂量使用可有效抑制老年心肌细胞的凋亡。由于活性氧本身在体内能产生破坏性更强的羟自由基，少量就能诱导多种细胞凋亡45。大剂量VE的抑制老年心肌细胞凋亡作用可能与大剂量的VE解除了SODH2O2复合物中的H2O2，SOD活性增加有关；同时大剂量的VE由于其自身的抗氧化能力的提高，也可有效的减少心肌细胞的凋亡。而小剂量VE这种作用较弱，无法有效阻止心肌细胞产生羟自由基，达到抑制凋亡的作用。假手术组心肌细胞凋亡很少是雌激素对
10、心肌细胞的强大的保护作用所致。而且，在无雌激素条件下，VE通过基因调控途径发挥的作用是否发生改变，在本实验条件下，仍无法推测，有待进一步探索。 综上所述，VE可轻度提高体能的抗氧化能力，对衰老雌性大鼠心肌的抗氧化作用有所贡献，在没有雌激素参与的情况下，VE单独抗心肌衰老的能力有限，需在很大剂量下，才能发挥明显的抗心肌细胞衰老的作用。在进行VE的临床使用时，可配合其它药物使用。【参考文献】 1 赵行宇，王月鹏，孔亚坤，等.维生素E对老年雌性大鼠血清雌二醇及心肌细胞Bcl2的影响J.吉林医药学院学报，2008，29（1）：12.2 谢书阳,杨玲玲,陈 浩,等.Aβ和氧自由基诱导的培养神经
11、元凋亡及维生素E的保护作用J.中国老年学杂志,2005,25(4):436438.3 赵 红,张玉媛,马儒林.大豆异黄酮对高脂血症大鼠体内SOD、GSHPx活力及MDA含量的影响J.实用全科医学,2005,3(3)：191192.4 Forrest V J,Kang Y H,McClain D E,et al.Oxidative stressinduced apoptosis prevented by TroloxJ.Free Radic Biol Med，1994，16(6):675684.5 Lennon S V,Martin S J,Cotter T G.Dosedependent induction of apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuliJ.Cell Prolif，1991，24（2）:203214.申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于 学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。
