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1、【摘要】目的经流式细胞仪(FCM)检测外周血T淋巴细胞表面HLAB27抗原，探讨其在强直性脊柱炎诊断中的临床意义。方法分别用流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测外周血T淋巴细胞表面HLAB27抗原并进行对比。结果流式细胞仪检测86例强直性脊柱炎患者标本，79例阳性，微量淋巴细胞毒法检测为76例阳性。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测HLAB27抗原无显著性差异。结论通过流式细胞仪检测HLAB27抗原，方法简便，稳定性好，重复性高。【关键词】HLAB27抗原；流式细胞仪；强直性脊柱炎【bstract】ObjectiveTostudytheclinicalevaluationofHLAB27byflow
2、cytometryinthediagnosisofankylosingspondylitis.MethodsMicrolymphocytotoxicitytestandflowcytometrywereadoptedtodetectHLAB27expressionandthefollowingresultswerecomparedandanalyzed.ResultsThepositiveincidenceofHLAB27withflowcytometrywas91.86%(79/86)inankylosingspondylitispatients,whilethepositiveincide
3、ncewithmicrolymphocytotoxicitywas88.37%(76/86).Thedifferencebetweenthetwomethodswasnotsignificant(P0.05).ConclusionThedetectionofHLAB27expressionwithFCMisaneasy,stable,accuratemethodwithhighrepeatability.【Keywords】HLAB27antigen,flowcytometry,ankylosingspondylitis强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一种原因
4、未明的疾病，病变主要累及中轴骨骼和肌腱韧带骨附着点的慢性炎症性疾病1。早期以慢性双侧骶髂关节炎为特征，晚期骨突关节融合，韧带赘形成，脊柱韧带钙化，导致脊柱从颈到骶骨完全强直。一般患者要在发病后7年左右才能被诊断，早期诊断有助于早期治疗，防止致残。研究发现,HLAB27与AS的相关性是迄今为止所知的HLA与疾病相关性最强的，其相对危险度达87.4,超过90%的AS患者其HLAB27抗原表达阳性，普通人群中仅5%10%为阳性。人群中HLAB27亚型的研究和转基因动物模型的建立都有力地证实了HLAB27分子在AS发病中的重要作用2。本文采用荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的HLAB27抗原相结合，通过
5、流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞HLAB27的表达，并与微量淋巴细胞毒法进行比较。1对象与方法1.1检测对象2004年5月2006年5月本院门诊及住院AS患者86例，男74例,女12例,年龄1360岁,均符合AS诊断标准；病程3个月9年,排除其它疾病。健康对照组40名,男28名,女12名,年龄1558岁。1.2方法1.2.1流式细胞仪法：染色步骤:采静脉血1ml,肝素抗凝。取30l抗HLAB27FITC/抗CD3PE抗体于试管中,加入50l抗凝血，混匀，室温避光孵育15min。然后加入110稀释的裂解液2ml，避光10min，待红细胞完全溶解后，立即300r/min离心5min，弃上清，用PBS
6、洗涤1次，同上离心后弃去上清。加入300lPBS重悬细胞，以备上机检测。FCM检测：先用CaliBRITEbeads和HLAB27calibrationbeads调试机器，并通过试剂批号的后缀确定界值（decisionmaker）的位置。在BD公司的HLAB27自动软件下获取15000个细胞，检测其中的T淋巴细胞HLAB27荧光强度,进行数据自动分析。1.2.2微量淋巴细胞毒法：抽取检测对象静脉血4ml，肝素抗凝。用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞,Hanks液清洗3次,将细胞浓度调整至2106ml1。取1l细胞悬液加于HLAB27板的抗体孔上，30min后加5l的补体，室温孵育60m
7、in。用5%伊红溶液5l染色2min，甲醛固定,4过夜，次日于倒置显微镜下观察阳性率。死细胞比例020%计为2分，30%40%为4分，60%80%为6分，80%100%为8分。结果判定如下：阴性对照孔为2分，阳性对照孔为8分，符合此条件者为有效结果；HLAB27孔为4分或4分以上阳性，4分以下为阴性。转贴于 中国论文下载中心 http:/www.studa.ne1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件包分析。2结果HLAB27自动软件首先通过FSCSSC点图,区分经裂解红细胞处理后外周血中淋巴细胞、粒细胞和单核细胞三个细胞群。然后在FSCFL2点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置,自动设定
8、一个CD3+T淋巴细胞门，以去除体积过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的细胞为CD3+T淋巴细胞,根据FSCFL2双参数,可将随后进行的分析定位于T淋巴细胞。软件随后计算FSCFL2门内细胞抗HLAB27FL1信号的平均荧光强度，并与界值比较，如果小于仪器设定的界值，为HLAB27阴性,如大于(或等于)设定的界值为HLAB27阳性。通过流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者共86例，其中HLAB27阳性79例，阳性率为91.86%。健康对照组40例，其中HLAB27阳性4例，阳性率为10%。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法分别同时检测外周血T淋巴细胞HLAB27抗原，经2检验，P005,两种检测方法检
9、测HLAB27抗原无显著性差异，详见表1。表1流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测HLAB27结果比较（略）3讨论强直性脊柱炎是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学资料显示,本病的发病高峰年龄为2030岁,40岁以后发病少见,男性比女性多见。过去认为AS是一种较少见的脊柱疾病,随着风湿病学在我国的起步和发展,认识到本病在国内并不少见。由于本病起病缓慢而隐匿,首发症状多为十分常见的临床症状腰痛或外周关节痛,临床上容易误诊。自开展HLAB27检测以来,临床误诊明显减少，诊断准确率提高。目前检测HLAB27的主要方法有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫法、流式细胞术、PCR法等。酶联免疫法适合大批标本检
10、测，结果重复性好,但步骤稍显繁琐。微量淋巴细胞毒法最为常用，这种方法尽管其操作简便准确性尚可，但仍受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性的影响，易出现漏诊或假阳性3。流式细胞术是一种快速、简便、准确的检测HLAB27的方法,其过程可自动进行,每分析一份标本只需30min,分析的值可被量化,明显减少了人为因素影响。利用荧光标记的抗HLAB27的单克隆抗体和淋巴细胞表面的HLAB27抗原结合,激光照射细胞表面抗原结合的荧光抗体,使其发出荧光，这种荧光的强度可通过流式细胞仪测得的通道值反映。根据通道值的高低判断HLAB27抗原阳性或阴性。但应注意的是由于其检测的是淋巴细胞表面的HLAB27
11、抗原,该表面的抗原可受感染等因素影响使HLAB27分子的数量或结构改变而出现假阴性;同时又由于存在抗体交叉性反应，导致可能出现假阳性。本实验表明流式细胞术快捷、简便、省时且稳定性和重复性皆优于微量细胞毒试验,当根据临床症状、体征及X线检查怀疑为AS时,外周血T淋巴细胞HLAB27可作为早期诊断及支持临床的重要指标。【参考文献】1VanDevLS,CanDerHD.AnkylosingspondylitisJ.Clinicalfeatures,RheumDisClinNorthAm,1998,24(4):663.2SartorRB.ColitisinHLAB27/beta2microglobulintransgenicratsJ.IntRevImmunol,2000,19(1):39250.3DunkyA,NeumullerJ,HubnerC,etal.HLAB27determinationusingserologicalmethods.AcomparisonofenzymeandamicrolymphocytotoxictestwithflowcytometryandmolecularbiologicalassayJ.RheumatolInt,1996,16(3):95295.转贴于 中国论文下载中心 http:/t
