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1、实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR引物。引物如下：引物名称序列F-cofilin-15-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3R-cofilin-15-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10mol/L，分装于Eppendorf管中，-20冰箱中保存备用。1.1.2 cofilin-1片段PCR 1
2、 反应体系：KOD polymerase(3-5核酸外切酶活性)2.5lKOD polymerase buffer5lMgSO42.5lDMSO（“万能溶剂”）2.5ldNTPMixture5lPrimerF（底物）1.5lPrimerR1.5lTemplate（模板）5lddH2O25lTotal50l2 PCR反应条件：94预变性3min94退火30s65延伸40s6840sgo to30个循环685min4forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min
3、，待凝胶稍冷却，加入2l EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。（2）把凝胶置于1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50l Marker、50l样品10l loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。4 割胶回收PCR反应体系的
4、扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。（2）称量凝胶块重量，以1g1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65加热至凝胶完全融化（约710min），每隔23min震荡一次。（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000g离心1min，弃滤液。（4）将柱子装回收集管中，加入300l binding bu
5、ffer， 10000g离心1min，弃滤液。（5）将柱子装回收集管中，加入700l SPW wash buffer，10000g离心1min，弃滤液。（6）重复步骤（5）一次。（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000g离心1min，以甩干柱子。（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入3050l的65预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000g离心2min，洗脱DNA。1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5，37培养过夜。质粒抽提采用Omega Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：1 取2
6、0冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5菌种50l接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置于37恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37，180rpm培养12h。2 加入200l GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000g离心1min，彻底去除上清，收集沉
7、淀菌体。4 加入200l Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。5 往重悬液中加入200l Solution ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。6 加入300l Solution ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，10000g离心10min。7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温下，10000g离心1min，弃滤液。8 将柱子装回收集管中，加入500l HiBind buffer。室温下，10000g离心1min，弃滤液。9 将柱子装回收集管中，加入700l Wash Solu
8、tion。室温下，10000g离心1min。重复该步骤一次。10 重复步骤9一次。11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000g离心1min，以甩干柱子。 12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入3050l的65预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000g离心2mi。跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。-20冰箱中保存备用。1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37水浴反应4h，反应体系如下：表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：表达载体15lcofilin-
9、1片段10l10H Buffer（代表缓冲液中盐浓度或成分不同）92l10H Buffer2lXhoI1lXhoI1lNdeI1lNdeI1lddH2O1lddH2O6lTotal20lTotal20l1.4 酶切产物的回收酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。步骤同PCR反应产物胶回收。1.5 连接反应将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收产物于16连接24h，反应体系如下：cofilin-1 cDNA酶切回收产物18lpET-28a酶切回收产物6l10 T4 DNA ligase buffer3lT4连接酶3lTotal30
10、l1.6 感受态大肠杆菌DH5的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）1 于-20冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37恒温箱中培养过夜。挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37， 180rpm培养12h。2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37，180rpm，培养2-3h，
11、当OD600=0.30.5时，停止摇菌。3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min左右。4 4，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80保存备用。1.7 连接产物的转化1 将感受态大肠杆菌从-80冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。2 将16l连接产物加入100L感受态大肠杆
12、菌中，轻轻混匀，冰浴30min。3 将Eppendorf管放入42水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。4 于EP管中加入400l LB培养基，置于摇床上，37，50rpm培养45min。5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20g)，置于37恒温培养箱中倒置培养过夜。1.8 双酶切鉴定重组子1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）的试管中，37，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37水浴箱中水浴4h。
13、反应体系如下：质粒pET28a-cofilin-11l10H Buffer1lXhoI1lNdeI1lddH2O6lTotal10l4 电泳分析。将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析1.8.2 重组子的序列分析挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37、180rpm过夜12h，15甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。并送样品英骏公司测序。2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的
14、制备具体方法和步骤同1.6。2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。于LB固体培养基（含卡那霉素20g）上划平板，并筛选阳性单克隆。2.3 cofilin-1的诱导表达挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100g/ml）中，37，180rpm培养至OD600=0.81.0。取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37下诱导4h。2.4cofilin-1的鉴定2.4.1SDS-PAGE电泳检测1 电泳样品制备。离心收集诱导后的菌体，将菌体沉淀重悬100l ddH2O中，并加入2SDS-PAGE loading buffer混匀，100加热10min，4保存备用。上样量（l）=270/（菌体OD600浓缩系数）；（浓缩系数=菌液体积/样品体积）2 电泳样品制备及凝胶的灌制。12%SDS-PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：成分分离胶(ml)浓缩胶(ml)30%丙烯酰胺溶液40
