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1、蛋白质间相互作用技术概述摘要:通过研究蛋白质- 蛋白质的相互作用, 能够更好地注释蛋白质功能, 解码生命现象。蛋白质相互作用研究方法的快速发展与不断完善为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文对当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法, 包括酵母双杂交技术,免疫共沉淀技术、蛋白质亲和层析等多种研究方法进行综述。关键词: 蛋白质; 蛋白质相互作用; 蛋白质功能1.前言蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中, 生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导和中间代谢等均受蛋白质间相互作用的调控1 有些蛋白质由多个亚单位组成, 它们之间的相互作用就显得更为普遍.
2、 有些蛋白质结合紧密, 而有些蛋白质只有短暂的相互作用. 然而不论哪种情况, 它们均控制着大量的细胞活动事件, 如细胞的增殖、分化和死亡. 通过蛋白质间相互作用, 可改变细胞内蛋白质的动力学特征, 如底物结合特性、催化活性; 也可产生新的结合位点, 改变蛋白质对底物的特异性; 还可失活其它蛋白质, 调控其它基因表达. 因此, 只有使蛋白质间相互作用顺利进行, 细胞的正常生命活动过程才有保障. 由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义, 因此其检测方法的研究也备受重视. 由生化方法, 如蛋白质亲和层析( protein af f inity chromatog raphy ) 、亲和印迹( aff
3、 inityblot ting ) 、免疫沉淀( immuno precipitat ion) 及交联( cr oss-linking ) ,发展到当今的分子生物学方法, 如以基因文库为基础的蛋白探测( pr otein probing ) 、噬菌体显示( phag e display ) 及双杂交系统( tw o-hybr id sy stem) 等. 另外, 还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法, 如表面胞质团共( surfaceplasmonreso nance) 等. 通过这些方法的联合使用,由实验得出的蛋白质间相互作用的结论显得更为可靠分子生物学方法尤其是双杂交
4、系统的建立, 使发现新蛋白质的方法更为简捷. 2.酵母双杂交技术1989年, Fie lds2 根据转录激活因子GAL4的特性建立了酵母双杂交技术, 用于研究蛋白质- 蛋白相质的相互作用。转录激活因子GAL4 的N 端是DNA 结合域( DNA binding dom a in,DNA- BD) , 可以与DNA分子的上游激活序列结合; C 端是转录激活域( activa tion dom a in,AD), 用于激活下游基因的转录。当DBD与AD结构域在细胞内充分接近时, 呈现GAL4转录因子活性启动下游基因的转录过程, 而两个结构域单独分别作用不能够激活完整转录反应。在酵母细胞内将诱饵蛋白
5、与猎物蛋白的核酸序列分别同DNA - BD和AD的核酸序列融合表达, 如果目的蛋白在细胞内存在相互作用, 则转录激活因子GAL4启动报告基因的转录表达, 通过被调控表达的半乳糖苷酶的活性检测目的蛋白相互作用关系。酵母双杂交系统在蛋白质- 蛋白质相互作用研究方面, 具有非常高的灵敏度, 特别是在用于研究蛋白质间微弱的、瞬时的相互作用时都能够通过报告基因的表达产物敏锐地进行捕获。Redd i等3利用酵母双杂交技术研究肝炎B 病毒反式作用因子HBx蛋白,结果表明H Bx蛋白可以通过其C 末端区域产生自我偶联作用。Shi Y等4 2009年利用酵母双杂交系统从分子水平研究了酪蛋白激酶2( CK2)与有
6、丝分裂原和应激活化型蛋白激酶(MSK1) 的相互作用关系。发现MSK1蛋白既与CK2调节亚基相互作用, 也与CK2催化亚基相互作用; 而CK2催化亚基只与MSK1蛋白C 端激酶区相互作用。人们在利用酵母双杂交技术进行蛋白质相互作用研究中,也同时发现酵母双杂交技术存在不足。一是要求发生相互作用蛋白在细胞内的定位较严格, 对于存在于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白, 酵母双杂交均不能检测; 二是融合表达蛋白存在着影响目的蛋白折叠和修饰不确定性, 特别是在研究异源蛋白相互作用时, 融合表达蛋白如果不能正确折叠和修饰, 则影响蛋白的活性, 干扰蛋白质相互作用。3.免疫共沉淀技术(co-im
7、munoprecipitation)免疫共沉淀是确定蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效技术,是利用抗原抗体的特异性结合特点来鉴定蛋白质相互作用的方法。在非变性温和条件下裂解细胞,可保持细胞内蛋白质间的相互作用, 再加入诱饵蛋白抗体产生免疫沉淀反应, 则与诱饵蛋白稳定结合的猎物蛋白也共同沉淀下来, 再通过电泳分离、质谱鉴定具有相互作用的猎物蛋白。Operana等5 利用免疫共沉淀技术研究UGT1A蛋白之间的相互作用, 发现UGT1A家族蛋白在膜上可形成寡聚体, 推测寡聚体可能影响蛋白质功能与底物选择性。W a lker等6 利用免疫共沉淀技术研究发现死亡蛋白和p53蛋白在白血病的血细胞的细胞
8、质中具有相互作用,而在正常血细胞中则没有。免疫共沉淀研究的是存在于正常生理条件下蛋白质间的相互作用, 可以排除蛋白质过量表达所引起的假阳性, 是确定蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。但该方法也存在几个缺点, 一是制备抗体过程比较繁杂, 二是免疫共沉淀的灵敏度不高, 受到细胞内诱饵蛋白质浓度限制, 只有较高浓度诱饵蛋白质才能与抗体结合形成沉淀。三是在验证蛋白质相互作用过程中需要进行一系列的清洗操作, 因此该方法不能检测到细胞中的低亲和与瞬间的相互作用, 仅适用于在细胞裂解液中保持完整生理复合体的蛋白质。4.蛋白质亲和层析其基本原理是: 将感兴趣蛋白偶联到诸如Sepharose 的基质上
9、, 并用它从合适的抽提液中筛选与基质上蛋白结合的蛋白. 大部分蛋白通过这样的柱子后, 易在低盐条件下被洗脱掉, 然后用高盐、辅助因子、离液序列高的溶剂或十二烷基硫酸钠( SDS) 洗脱保留的蛋白. 保留能力强的蛋白比弱的更可能与感兴趣蛋白相互作用. 例如: Mason 等利用该方法发现两个大肠杆菌抗转录终止因子即NusB 和核糖体蛋白S10 能相互作用7.将S10 偶联到Af fi-Gel 基质上,大肠杆菌粗提物通过该柱, 用不同条件洗脱, 收集洗脱蛋白, 进行SDS-PAGE 分析. 用抗N usB抗体进行Western blot ting 进一步证实, NusB 能与S10 相互作用. 该
10、方法的优点是:(1)非常敏感, 检测的结合常数可低至10- 5 mol/L;(2) 同等对待提取物中的所有蛋白;(3)既可检测蛋白结构域, 又可检测重要残基;(4)可检测含有多个亚单位的蛋白的亚单位间的相互作用. 影响检测的因素包括被偶联的蛋白的纯度、浓度、抽提液的数量及偶联后蛋白的结构等.5.串联亲和纯化技术( tandem affinity pur ification, TAP)1999年R ig aut等8 提出了一种新的分离蛋白质复合体的方法- 串联亲和纯化技术。该方法利用基因技术在融合蛋白一端加入TAP标签, 即钙调蛋白结合肽( ca lmodu lin- b ind ing pep
11、tide, CBP) 和蛋白A 的IgG 结合域, 用烟草蚀纹病毒( tobaccoetch v irus, TEV)蛋白酶切位点将二者连在一起。将目的蛋白与TAP标签CBP端相连, 转染入细胞内融合表达。在非变性温和条件下裂解完整细胞, 保持在生理条件下目的蛋白与内源相互作用蛋白质复合体稳定。用IgG 为配基的亲和柱分离纯化, 初步洗脱杂蛋白后, 用含有TEV 蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割洗脱下来, 获得含有CBP的目的蛋白复合体; 再与偶联钙调素的亲和柱结合, 充分洗脱纯化得到复合体, 经过凝胶电泳、质谱分析鉴定相互作用蛋白质。TAP技术具有融合蛋白亲和层析和免疫共沉淀两种技术的优点:
12、 细胞内融合表达蛋白质复合体避免了非自然条件下的蛋白质相互作用, 两次特异性亲和层析去除了杂蛋白的干扰, 提高了研究结果的真实性。而且操作过程中洗脱纯化及酶切条件温和, 很好地维持了蛋白质复合体的结构, 有利于研究蛋白质相互作用的关系。TAP技术操作方便、结果真实等优点使其在蛋白质相互作用研究中应用获得极快发展。Roh ila 等9 利用TAP技术研究水稻蛋白激酶的相互作用蛋白, 结果表明56% 的具有TAP标签的蛋白激酶发生了蛋白质相互作用, 证明了TAP技术在水稻植物中研究蛋白的相互作用是有效的。酪氨酸磷酸酶非受体型底物-1( Tyro sine phospha tasenon - rec
13、eptor type substrate-1,SHPS-1)是一个跨膜蛋白, 在细胞迁移与增殖中具有重要作用。SHPS- 1蛋白质磷酸化受到胰岛素样生长因( insulinlikegrow th facto r- I, IGF- I)调节。Shen X等10 利用TAP技术研究发现一些与磷酸化的SHPS-1蛋白质相互作用新蛋白质,包括热激蛋白、蛋白激酶、磷酸酯酶和一些调节转录与翻译蛋白质。其中大多数蛋白质在胰岛素样生长因子( IGF- I)调节下表达量上调, 少量蛋白质表达量下调。6. 蛋白质微芯片技术蛋白质微芯片( pro tein ch ip)技术是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项
14、高新技术, 其基本原理是, 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜或载玻片等各种载体上作为检测用的芯片, 然后, 用标记了特定荧光抗菌素的蛋白质或其他成分与芯片作用, 将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去,再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术, 测定芯片上各点的荧光强度, 通过荧光强度分析蛋白质间的相互作用, 最终达到测定各种蛋白质功能的目的。Zhu等11 将生物素化的钙调蛋白固定于载玻片上,采用蛋白质微芯片技术测定其与酵母蛋白质组中球蛋白的相互作用, 结果, 测得39种已知的钙调蛋白与激酶可产生相互作用, 并发现33种新的蛋白质与钙调蛋白存有潜在的相互作用。目前, 以日本科学家田中教授发明的
15、/ 对生物大分子的MS 分析法0为应用原理、由美国C iphergen公司研发生产的蛋白质微芯片-飞行质谱仪, 已经在国内外的多个蛋白质组学研究机构得到广泛应用12, 其最大优点是检测快速、简便易行、样本用量少、可进行高通量分析, 具有高度并行性、多样性、微型化和自动化的特点; 不需进行蛋白质分离, 只是利用抗体或其他类型亲和探针构成的芯片, 即可直接在不经处理的各种体液和分泌物中进行检测等, 并可同时检测几千种蛋白质, 效率非常高, 且可检测到样品中特异性蛋白质的分子质量。因此, 此项技术在蛋白质组学研究中较现有常规方法更具优势。蛋白质微芯片技术不同于基于简单的核酸杂交的DNA 芯片) )
16、) DNA 分子的组成只需4 种核苷酸, 其芯片中蛋白质具有复杂的连接方式, 且由很多构件模块组成, 需要高品质和包含广泛的表达文库、较好的排列产物的方法和大量活化的功能蛋白, 这就使得蛋白质微芯片在固定蛋白质的稳定性方面比DNA 芯片面临更大的挑战。7. 展望随着蛋白质相互作用研究技术发展, 用于蛋白质- 蛋白质相互作用研究的方法越来越多。总的来说, 选择一种合适的蛋白质相互作用研究方法主要从下面几个方面考虑: ( 1) 研究方法具特异性, 可以鉴定特异的相互作用蛋白质; ( 2) 尽量避免假阳性和假阴性的结果; ( 3) 尽量地研究蛋白质在生理状态下的相互作用。随着计算机技术的发展, 许多研究者通过计算机模拟蛋白质相互作用网络, 发现了更多有相互作用的蛋白质, 但这仍然需要利用以上提到的实验方法进行充分验证。相信在今后很长一段时间内, 各种方法技术并存, 相互间交叉互补, 将成为蛋白质相互作用研究的主要特点。文献1 Ph izick y E M,
