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1、Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系 作者：张洁刘作功郭雄赖江华【摘要】 目的 探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法 采用临床流行病学方法调查，随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样，提取基因组DNA，采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果 慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论 Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。【关键词】
2、克山病； Desmin基因；易感基因；克山病与扩张性心肌病(dilatedcardiomyopathy, DCM)的主要病理变化均为心肌的变性、坏死、纤维化(替代瘢痕)，最终导致心脏功能失代偿 1，两病在心肌病理学变化、临床症状体征上均缺乏特异性的鉴别诊断指标。近年来已发现一些与DCM相关的基因突变，如细胞骨架蛋白基因(desmin、dystrophin、lamin A/C、sarcoglycon、Metavinculin等)和心肌肌小节成分蛋白基因(Actin、atropomyosin、Troponin T、MHC、Titin、cMyBPC、MLP等)34。国内报道克山病患者心肌组织中Des
3、min荧光染色明显异常，离病灶越近Desmin改变越明显，且与病程成正相关，以慢型克山病多见。已知desmin基因的多个突变中，exon6错义突变与DCM相关性较大，但与慢型和潜在型克山病的关系仍不明确。为此，本调查采用PCR和凝胶电泳的方法检测慢型和潜在型克山病患者中是否存在与DCM患者相同的desmin基因exon6错义突变，以寻找可能的鉴别诊断指标。1 材料与方法调查对象与分组 选取陕西省黄陵县店头镇各乡296例、非克山病病区西安市长安区 30例为调查对象，依据中国克山病诊断标准(标准编号：GB1702121997)，检出慢型和潜在型克山病患者 82例，临床表现主要有心律失常、多发性室早
4、、房颤等 ，其中慢型克山病患者占% (14例)，潜在型患者占% (68例)。随机抽取克山病患者组30例(病例组)，病区内正常对照组30例(内对照组)。非病区正常对照组30例(外对照组)。方差分析病例组与其他两组年龄和性别没有显着性差异。样品采集与处理 使用含知情同意书的统一调查表进行调查后，采集肘静脉血5mL，EDTA抗凝，冰块保存运输，置-25冰箱低温保存。实验方法外周血DNA的制备 血样采用盐析法制备DNA，用于做PCR扩增和基因突变的酶切分析。Desmin基因突变位点与引物序列选择 Desmin的基因组DNA全长11990bp，有9个外显子，其中exon6的突变类型为A360P位点错义突
5、变，exon6上、下游引物序列来源于文献 ，分别为5CCTCTCCTGCAGAACGATTC3；5TCCTGCCTGGCCCCTCAC3。含exon6的片断长度为250bp，如果在基因组DNA的6211位点发生A360P错义突变，则用内切酶Bsp1286I可将该片断切开为两个分别为184bp和66bp的片断。为保证实验体系及内切酶的有效性，特设定内对照。选择内切酶Bsp1286I，将desmin基因序列输入相应软件中，可看到酶切位点在5407，而5407位点位于exon4片段内，故用PCR扩增exon4片段，可被Bsp1286I切为长度分别为60bp、122bp两个片断。Exon4的引物来源于
6、文献，序列为5AAGCCCAGTCATGCCCTACA3， 5CTTCGACTTGTACCACTCCTCAGC3。Desmin基因PCR扩增步骤 标准的PCR反应体系： 20L模板DNA为200ng 基因组DNA，TrisHCL() 20mmol/L、KCl 50mmol/L、MgCl2 /L、dNTP各50mol/L，正反义引物各mol/L，Taq DNA聚合酶 。PCR反应条件：94变性30s ；57退火30s ；72延伸1min；最后72延伸5min，循环30次。对PCR扩增的基因片断exon6及内对照 exon4选用限制性内切酶Bsp1286I进行酶切。琼脂糖凝胶电泳及银染 配制/L琼
7、脂糖用于电泳，50V电压，电泳20-40min。分析、比较各组酶切图谱。2 结果exon4酶切位点分析 Bsp 1286I将内对照exon4片段酶切为60bp和122bp两个条带(图1)。克山病组、病区正常对照组和非病区对照组exon6片断酶切结果 见图2、3，各组酶切前、后均只有一条250bp条带。比较3组电泳结果，desmin基因exon6片断均未被Bsp1286I内切酶切开。图1 内对照组exon4被Bsp1286I酶切鉴定结果Identification of exon4 by restriction endomuclease Bsp1286I图2 克山病患者exon6片断酶切前PCR
8、电泳图Electropherogram of exon6 in keshan disease cases before incided by Bsp1286IM: DL 2000 marker; 1-22: the cases of keshan group图3 各组exon6片断被Bsp1286I酶切鉴定结果Identication of exon6 in different cases digested with Bsp1286IM: DL2000 marker; 1-16: the cases of people in the group.A: keshan group; B: norm
9、al control in the area of keshan; C: normal control in the area of nonkeshan3 讨论 慢型克山病与DCM除地区分布不同外，其心肌病理学变化、临床症状体征上均具有许多相似的表现。尽管克山病心肌组织中desmin蛋白荧光染色出现明显异常，但在本次调查中未能证实慢型和潜在型克山病患者desmin 基因exon6出现A360P错义突变引起的蛋白变性，表明desmin基因exon6的A360P错义突变与慢型克山病心肌损伤关系不密切。有调查报道DCM家族中先证者与其发病同胞中有desmin基因A360P和N391I错义突变，酶切分
10、析显示少数亲属可出现其中的一种突变，但未发病，说明A360P错义突变有一定的外显率。同时在211例健康对照者中未发现其中任一种错义突变，提示该突变非一般的基因多态性表现。有这两种错义突变的DCM患者多表现传导缺陷、偶发性昏厥和心衰等。在限制型心肌病心肌细胞中亦可见到类似的改变，可能是遗传基因异常所致心肌结构蛋白质desmin蓄积，破坏心肌纤维正常结构，影响其收缩及舒张，进而参与疾病的发生发展。因此，初步分析认识到慢型克山病心肌损伤可能与DCM有不同之处。 基因突变本身发生概率很低，样本量不足的情况下，难以发现阳性突变，本次调查随机抽取慢型克山病患者30例，病区对照30例和非病区正常对照30例。
11、有报道认为特发性扩张性心肌病发病率约/10000，其中只有20%- 30%有家族聚集现象。在较低发病率的情况下发现突变的概率也随之减低。因此，本次调查慢型克山病患者未检出exon6的A360P错义突变，难以排除因样本含量较少而未检出阳性改变的可能性。其次，可导致扩张性心肌病的基因突变较多，其中在desmin基因的9个外显子中，仅仅exon6上已知和DCM有关的基因突变就有A360P和N391I错义突变。所以虽然本次调查未发现慢型克山病有exon6位点A360P错义突变，但还不能排除其他位点有基因突变的可能性。【参考文献】 1夏德义, 张卫星. 克山病、扩张性心肌病诊断与鉴别德几个问题探讨 J.
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