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1、提取核蛋白方法:1 称取适量材料(约10克)于25毫升研磨缓冲液A中研磨至匀浆, 六层纱布过滤,2300g离心10分钟,弃上清.注意: 过滤得时候不要用手挤压.让它自然流出即可.2 用重旋缓冲液B (1.5毫升)重旋,加入260微升饱和硫酸铵,于4度轻摇30分钟,(可以将离心管放在冰盒里,然后把冰盒放在摇床里摇,转速设置为100转每分钟即可)3 12000g离心10分钟,取上清至一新管,加入3倍体积的饱和硫酸铵,冰上放置1小时,每隔20分钟颠倒混匀一次, 这时可以看见一些絮状的蛋白漂浮在管中.4 12000g 离心,去上清,沉淀用1ml重旋缓冲液C重旋.取20微升蛋白电泳观察.考染后可以看到一
2、片蛋白带,各种大小都有.5 将蛋白过夜透析,透析液为蛋白-DNA结合缓冲液D6 将透析后的蛋白分装,液氮速冻后零下70度保存.研磨缓冲液ATris-Cl(pH7.8) 50mMMgCl2 5mMKCl 15mM蔗糖 0.3MEDTA0.1mMDTT1mMPMSF0.5mM重旋缓冲液BHEPES-KOH (PH 8.0) 20mM甘油25%(体积比)EDTA 0.4mMPMSF0.5mMDTT1mM重旋缓冲液CHEPES-KOH (PH 8.0) 20mM甘油25%(体积比)EDTA 0.4mMPMSF0.5mMDTT1mMNaCl 0.1MDNA-蛋白结合缓冲液 DTris-Cl ph7.8
3、10mMNaCl 50mMDTT 0.5mMEDTA 1mM甘油5%体积比注意:上述缓冲液后面的浓度均为工作浓度,可以配置合适浓度的母液,在配置的时候加入母液即可.EMSA1 片段的标记在感兴趣的片段两端设计含有合适酶切位点的引物,用高保真酶进行扩增,将PCR产物沉淀后酶切,然后回收.利用末端补平酶进行补平.进行标记.反应体系如下10* BUFFER 1DNA Fragment 210mMdA/T/GTP 1P32-dCTP4Klenow Fragment o.5水1.5其他物质先加好,然后加同位素,最后加酶.37度标记一个小时.2 做蛋白和DNA结合结合体系为20微升标记的启动子片段 5微升
4、蛋白 5微升Poly dI-dC2微升xxxxxxxx8微升25度反应1小时根据不同的实验需要,可以设置不同的XXXXXXX1 全部加水 只检测二者之间的结合2 加未标记的启动子片断,可以检测结合的特异性3 如果你标记的片断比较长,比如是500bp,那么可以把这500分成5个100,然后分别加入不同反应体系,根据结合的抑制情况,可以分析结合的具体位点.跑胶 制作非变性聚丙烯酰胺凝胶,根据片断大小设置合适的浓度,跑胶.跑完之后铺一层滤纸,小心揭下,晾干,压片.(这个飞哥肯定比我熟练,呵呵).第二天洗片子,观察结果.此外,张老师没有给我订购Poly dI-Dc,我用的鳜精DNA替代,效果不好,非特异性结合很多,你们最好订购.我的实验结果没有扫描,就和你们说一下,就是下面有一条比较淡的DNA条带,上面有一条很粗大的结合滞后带,其他的没有了.
