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1、免疫组化（IHC）与病理诊断 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）是临床病理诊断中常用的 技术和手段。从 20 世纪 70 年代开始，免疫组化技术就已经应用于病 理诊断,对诊断肿瘤、肿瘤分类、判断预后产生了巨大的影响,同时 也扩展了人们对于各种疾病及肿瘤形成过程的认识,提高了病理诊断 与研究水平。本文重点讨论了免疫组化技术在临床上的应用与常见的 免疫组化指标在临床上的意义。1、什么是免疫组化?在了解免疫组化在临床上的应用之前,我们先来了解下什么是免疫组 化。免疫组化,是应用免疫学基本原理抗原抗体反应,即抗体和 抗原之间的结合具有高度的特异性,先将组织或细胞中的某种
2、化学物 质提取出来,以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异 性的抗体,再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。由于抗 原与抗体的复合物是无色的,因此还必须借助于组织化学的方法（荧 光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来,以 其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究 （Figure 1）。Figure 1. The theoretical diagram of IHCantibody EnzviX AvidSnA BiotinPrimary anUbody免疫组化针对的样本主要是组织。组织是来自患者或动物，经过冷冻 或石蜡包埋。将这些组织制成约4“
3、m厚的切片，封片后再处理。若 样本是细胞，通常被称为免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)。 对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细 胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物(如血涂片、 拭子等)，或在实验室中进行的组织培养细胞系。2、什么是病理诊断?病理诊断是研究疾病发生发展和疾病过程中患病机体形态结构、功能 代谢改变与疾病转归，从而为疾病的诊断、治疗与预防提供必要的理 论基础和实践依据。病理诊断是对手术切下或尸体解剖取下的肿瘤标本进行固定染色后， 在显微镜下进行组织学检查，以便于诊断疾病。样本更多源于活人。 尽管各种影像学技术飞
4、速发展，但是病理诊断仍然是肿瘤各种检查方 法中最可靠的，病理诊断被喻为“金标准”，也是疾病的最终诊断。如 果将病理诊断和生化免疫等检验诊断进行比较，病理诊断就好像警察 办案获得的指纹、脚印、DNA等实际证据。因其通过显微镜观察疑 似病变组织的细胞形态和结构，可直接看出组织发生了怎样的病理变 化，能较准确地对疾病做出判断，尤其在肿瘤性质的诊断上更为常用。 而免疫组化，就是病理诊断中最常用的检测技术。3、免疫组化技术在临床上的应用目前免疫组化技术应用于临床主要有以下几个方面：肿瘤良恶性的判断：对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免 疫球蛋白(Ig)的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来 区
5、别。确定肿瘤分期：肿瘤分期是判断预后的一个指标，与是否浸润、 有无淋巴管或血管侵袭密切相关，而通过免疫组化方法可以判断肿瘤 是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。细胞属性的判定：通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分， 来判定细胞的属性，确定肿瘤的来源。确定来源不明的转移瘤的原发部位：对于来源不明的转移瘤， 用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源，进一步确定原发 部位。如角蛋白抗体(CK20)在胃肠道癌、胆管癌、胰腺癌中阳性，而 在肺癌、乳腺癌、肾癌中阴性。对“未分化”恶性肿瘤的分类：未分化恶性肿瘤包括癌或肉瘤， 在 HE 切片上由于肿瘤的“未分化 ” 而缺少肿瘤细胞的起源特征不能分 类，初步
6、区分组织学类型用非特异性抗体，在其基础上再选用特异性 抗体做进一步鉴定。进一步分类不同器官与组织交界处肿瘤：由于重叠的特征，在 一些组织器官交界处的肿瘤，仅凭组织学基础对肿瘤进行分类很困 难。如发生于组织交界处的肿瘤有睾丸胚胎癌与精原细胞癌，两者较 难区别，且治疗与预后显著不同，但用免疫组化检测角蛋白就较易于 区别：角蛋白阴性则为精原细胞癌，而角蛋白阳性则为胚胎癌。及时准确的发现微小转移灶：在常规组织切片中，辨别单个或 几个转移性肿瘤细胞很难，淋巴结内窦性组织细胞增生与某些癌的早 期转移有时也不易区别，而采用免疫组化方法，有助于及时准确的发 现微小（癌）转移灶。4、病理诊断中免疫组化的局限性但
7、是，随着免疫组化的广泛应用，发现免疫组化技术存在一些局限性。 在肿瘤诊断中评估免疫组化的局限性主要在抗体特异性和解释方面。 在免疫组化操作过程中中都必须有适当的阳性与阴性对照，作为技术 完整性质量控制，如对照组被忽略或不理想时，免疫组化染色的结果 要谨慎对待，免疫组化的正确结果，不仅要依靠技术步骤上规范化操 作，而且有赖于正确的解释，在报告免疫组化染色结果时不应孤立地 解释，应考虑到诊断与鉴别诊断、所应用的抗体特性、所研究组织性 质，同时还要注意假阳性与假阴性结果的干扰。深入研究免疫组化原 理和技术，必须熟悉各种抗体真阳性反应部位，实现实验室间免疫组 化标准化，使免疫组化在病理诊断中发挥最大的
8、辅助作用。4.1假阳性PositiveNegative阳性信号定位不正确即为假阳性，包括着色不匀、背景着色、边缘效 应，另外组织的某些特定成分也能导致假阳性结果。假阳性可能的原 因有:(1) 一抗浓度及一抗是否失效，抗体有一个合适的浓度范围且必 须在有效期内使用，过期的抗体或者不着色，或者背景着色，形成假 阳性;(2)试剂未充分覆盖组织，组织边缘的试剂易干浓度较组织中间 高致深染;(3)抗体孵育时间过长，由于室温的影响夏季孵育时间稍短， 冬季孵育时间稍长；(4)操作过程中组织变干，造成组织边缘收缩或损 坏形成伪影，产生假阳性;(5)3, 3-二氨基联苯胺(DAB)显色时间太长，DAB宜现配现用
9、，配制时间最好在30min以内;(6)由于胞浆里含有较 多的蛋白质，因此间质和胞浆中出现很多非特异性的染色，如内源性 酶血红蛋白、肌红蛋白等造成的着色，可以通过血清封闭解决;乳腺 癌组织中的脂肪细胞、淋巴细胞也会产生非特异性的染色;(7)非特异 性抗体吸附常见于坏死组织中，使坏死组织呈较高的背景染色，在免 疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块。4.2假阴性Cor rectCor rectFa IseNegativePositivePositive免疫组化结果中的假阴性是指所有抗体标记的切片均呈阴性，无阳性 信号，假阴性结果不是真实的反应。导致假阴性结果的原因有：(i)抗 原修复方法选择不当，根
10、据不同的抗原特点采用不同的修复方法，大 多数抗体要求热修复，热修复又包括高压修复、微波修复及煮沸热修 复;而对某些细胞内抗原和细胞间质抗原需要用酶消化，如表皮生长 因子(EGFR)要求胃蛋白酶(Pepsin)消化，而Vimentin则不用修复;(2) 一抗本身的问题:一抗效价降低或失效。在免疫组化中染色结果的假 阴性会导致错诊或漏诊，进而影响临床诊断及延误治疗。解决这一问 题的可通过设立阳性对照，比较两者染色结果。若阳性对照有表达， 表明试剂和染色体系及实验步骤均无问题;若阳性对照无表达，则检 测过程中某一试剂或某个步骤存在问题，应逐一查找原因。5、临床上常用免疫组化指标的意义大家都知道病理检
11、查是临床诊疗的金标准，尤其对于肿瘤患者，更是 一封判决书。其中免疫组化(IHC)的结果对肿瘤的诊断和治疗及预 后分析尤为重要。本文就目前开展的系列检查及意义进行了整理。5.1 恶性肿瘤的 Ki-67 和 p53 常规检查 目前的研究表明，大部肿瘤的复发、转移取决于 Ki-67 值和 p53 值， 而与肿瘤的组织的分型关系不是十分密切，如中分化腺癌，如果 Ki-67 和 p53 值超过 50%，预后不佳。相反，如肿瘤的组织分型为 低分化腺癌，而 Ki-67 和 p53 值较低，预后也会较中分化或高分化 癌的预后稍好。5.2耐药预后标记全套4项：P-gp, GSTn, TOPOII, Ki-67
12、P-糖蛋白（p-gp）-药泵作用-胞膜/胞浆-阳性率越高，对下列药物耐 药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长 春新碱、紫杉醇及泰素帝。谷光甘肽S转移酶（GST n）-解毒作用-胞浆-阳性率越高，对下 列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺及瘤可宁。拓扑异构酶II（TOPOII）-靶点作用-胞核-阳性率越高，对下列药 物越有效：蔥环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP-16、替尼泊苷、玫瑰 树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者 对 VP-16 尤其有效。Ki-67-细胞增殖标志-胞核-阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度 越高。5.3 乳腺癌五项（
13、ER、PR、C-erbB-2（Her-2）、Ki-67、p53）乳腺癌耐药预后标记，全套7项：P-gp，GSTn，TOPOII，Ki-67，ER， PR， HER2。雌激素受体（ER）-性激素作用-胞核-阳性率越高，肿瘤对内分泌 治疗越有效，预后越好。孕激素受体（PR）-性激素作用-胞核-阳性率越高，肿瘤对内分泌 治疗越有效，预后越好。C-erbB-2-癌基因产物-胞浆-阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。p53 种抑癌基因，分野生型（Wtp53）和突变型（Mtp53）。野生 型 Wtp53 因微量免疫组化难以检测，突变型 Mtp53 能够被免疫组 化测定，突变后则丧失了启动细胞凋亡的能力。突变型
14、p53 高表达， 细胞的高度增生、分化程度差分化、恶性程度越高、预后不良，公认 预后差指标之一。5.4 垂体腺瘤功能六项检查LH （促黄体生成素），FSH （卵泡刺激素），ACTH （促肾上腺皮质 激素），TSH （促甲状腺素），PRL （泌乳素）、GH （生长激素）。 根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。5.5 GIST （胃肠道间质瘤）诊断GIST 特征性表达 CD117（ 95%）GIST 特征性表达 DOG1， DOG1 阳性表达部位与 CD117 相似DOG1 可以表达于部分 CD117 阴性的 GIST 中（ 6%）DOG1在胃部GIST、上皮样GIST、PDGFRA突变的病例
15、中，表达率高大多数表达CD34 (70%)、局灶性表达SMA (40%)、S-100蛋白( 5%)、通常不表达 desmin( 2%)。标准免疫组化染色套餐是：CD117、DOG1、CD34、SMA、S-100和Desmin。可依据组织形态表现，添加需要的鉴别染色抗体。5.6 淋巴瘤的 WHO 分型淋巴瘤 WHO 最新分型有 33 个亚型，每个亚型的预后和治疗方案 均有所不同，而淋巴瘤的诊断和分型又是极其困难的，是病理中的难 中之难，所以诊断淋巴瘤的免疫组化方案必须双份套餐式的，即 每一种组织的标记物必须用 2 种以上的抗体。诊断 B 细胞淋巴瘤，必须有 CD20 和 CD79a 阳性正面证实，同时 还需要用 CD3 阴性反面来证实，因此诊断淋巴瘤需 8-10 种左右的 抗体，才能准确地反应出淋巴瘤各种亚型的信息。
