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1、鬼峰产生的原因是多种多样的，根据本人的经验以及文献报道，将原因归纳为以下几个方面：1、流动相、样品稀释液、仪器或是容器中存在杂质，当梯度开始时由于有机相比例不高，洗脱能力 不强，杂质在色谱柱柱头富集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富集的杂质被洗脱，从而形成 鬼峰。2、流动相脱气不完全。空气在有机相和水中的溶解度不同，当水和有机相混合时，气泡就产生了3、操作问题原因 1主要有以下几种情况1、试剂问题a) 有机溶剂甲醇制备工艺相对乙腈来说较为简单，杂质含量也较少。但是由于甲醇紫外吸收范围比乙腈广，所以 当使用紫外检测器时，尤其是波长较低时，尽量使用乙腈作为有 机相，用甲醇的话漂移太大。而用 作
2、梯度色谱的乙腈质量要求较高，一般用进口梯度色谱专用乙腈能够很好的减少鬼峰的出现。b) 水 很多单位用自制蒸馏水作为水相，但是结果并不是很好。原因就是一些低沸点的有机杂质并不能够通 过蒸馏除掉。有条件的尽量用HPLC级的纯水，没有条件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替，但是 如果色谱条件比较严格也是有可能出问题的。c) 其它试剂缓冲盐、TFA、EDTA等试剂也会对流动相造成很大的影响，尽量用纯度高的试剂配制流动相。2、仪器问题a) 液相的流动相管路被污染。长时间的使用含水量较高的流动相(尤其是加入缓冲盐的)，细菌就容易在管路中滋生，细菌的代谢 产物或是细胞碎片能造成鬼峰。b) 输送泵故障，造成系统
3、压力不稳，从而产生鬼峰。c) 单向阀堵塞，造成系统压力不稳，从而产生鬼峰。早期岛津的液相单向阀貌似不能用纯乙腈作为 流动相，现在应该已经得到改进。原因 2主要有以下几种情况1、 在线脱气机脱气不完全。2、两种流动相的有机相比例相差太大。例如A为100%水，B为100%乙腈。在梯度条件允许的情况 下尽量减少两中流动相之间的差距，降低空气在两中流动相中溶解度的差异，从而减少气泡的产生。3、流动相配置好后预先超声脱气。原因 3主要有以下几种情况1、流动相配置过程中受到污染a) 盛放流动相的容器或是量具受到污染。这种污染可能来自于洗涤剂、铬酸洗液或是其他实验人员用完后的残留杂质。流动相容器的清洗一般
4、用干净的水+有机溶剂涮洗就行，过多的清洗步骤反而可能造成二次污染。有时流动相容器的塑料盖 碎片都有可能是杂质的来源。b) pH 计。很多pH计以聚碳酸酯作为外壳，然而聚碳酸酯是可以溶于有机溶剂的，所以尽量使用玻璃pH计来 测量流动相的 pH。c) 滤膜。 劣质的或者型号错误的滤膜往往是鬼峰出现的原因。d) 放置时间过长。流动相在空气中暴露时间过长，就可能吸收空气中的有机杂质，有时流动相中的添加剂，例如 TFA， 时间长了会氧化从而产生杂质。2、样品稀释液与流动相极性或者 pH 相差太大。这也是导致鬼峰的原因之一，这种问题很有可能导致样品分为两个不同的阶段出峰，从而产生双峰或 者多峰。以上就是本
5、人的一点经验，希望大家指正批评。高效液相色谱级乙腈的质量评价2009-11-01 21:19:451 分类：HPLC液相色谱| 标签：液色迷人液相色谱专家 |字号订阅高效液相色谱级乙腈的质量评价信息来源：液色迷人摘要:高效液相色谱（HPLC）分析中，流动相溶剂的纯度和质量对分析结果和仪器本 身都有重要影响。溶剂中的各种痕量杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性 定量分析结果，而且可能会污染分离柱和堵塞系统，造成仪器出现故障。了解HPLC溶剂 规格和相关的测试方法，可以帮助HPLC用户评价和筛选HPLC溶剂，减少溶剂杂质对应用 造成的负面影响。本文介绍了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度确
6、定HPLC级乙腈纯度和质 量的两种规范方法及其对HPLC分析的意义，并探讨了这两种方法的实际应用。乙腈区别于其他HPLC溶剂的独特性质（中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确 的色谱峰、低粘度、相对于醇类和酯类有较低的UV吸收）1,使其成为最常用的有机 流动相组分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种 很少量的杂质，例如丙烯腈、a（B）-甲基丙烯腈、顺/反式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、 乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、恶唑和乙酸2-4。经过复杂的纯化过程，痕量 的上述杂质可能仍然存在于HPLC级乙腈中。其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰， 进而影响定性定量分
7、析，而且会污染分析柱、堵塞系统，导致仪器出现故障。作为美国分析试剂标准测试方法的权威，美国化学学会（ACS）分析试剂委员会在试 剂化学品（第9版）中明确定义了 HPLC级乙腈的技术说明，包括通用的说明和HPLC 的适用说明。通用的说明包括气相色谱（GC）纯度、水、滴定酸或碱、以及挥发残留物。 HPLC的适用说明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脱基线5。本文详细介绍了乙腈的两种适用于HPLC的规范方法及其对HPLC应用的意义，并通过 详尽的实验数据讨论了操作中的注意事项以及影响测试结果的因素。1实验 1.1仪器本文中使用了两种HPLC系统，其特定条件介绍如下：Agilent 1100 HPLC
8、系统由脱 气机(G1379A)、四元泵(G1311A)、自动进样器(G1315A)和二极管阵列检测器(DAD) (G1315B) (Agilent Technologies, Wilmington, DE)组成，并用该系统获得图 1 和 图2的结果。其他色谱图由Alliance 2695 HPLC系统和2996光电二极管阵列(PDA)检 测器(Waters, Milford, MA)获得。ZORBAXC18 柱由 Agilent 提供；B&J C8 柱从 Honeywell Burdick & Jackson 获得。厨 1 btcnftW&H 瞬 K 脚 S*J )不冋阳牌乙鼎雍門5也巾址梯厦
9、冼脱蛊线z -8iJ AC Si. ffiSW A, KffiM 0 , 供应商匚= 鱼询果* BfiJ C8桂 11SO irm x Mnim LL S Jr 池陈 疏.lOfilB:捕盘(min.e% h 1 aOhf2O4 100)301 1DO|(35| 常片啊釦 规站明2： Sts it水戲污與更空口HJtt恍鵠牆睨的鬆响；-BKJ捕至HLG己睛 AGM k, TtlS面T的価娄MFLGACN, F庄肯T脚懈裳H=RLC*匚叫.色站时尽阿I.UV 光谱使用 Cary 4000 UV-VIS 分光光度计(Varian, Palo Al to, CA)。参比池为1 cm石英池，样品池为1
10、 cm或5 cm石英池。1.2药品和试剂HPLC级乙腈来自Honeywell Burdick & Jackson及其他HPLC溶剂供应商。高纯水由Milli-Q 超纯水系统(Millipore, Bedford, MA)和 Honeywell Burdick & Jackson供应。乙酸(AR)由 Sigma (St. Louis, M0)提供。2结果和讨论 2.1 HPLC级乙腈UV吸收规范的意义UV吸收背景对HPLC乙腈的关键性源于两个原因。首先，大部分有机杂质都会产生UV 吸收。乙腈的UV吸收越小意味着其中杂质含量越少。第二，HPLC仪器最常用的检测模式 就是UV检测。因此乙腈的UV吸收
11、越小，色谱的基线背景越低；从而灵敏度越高，检测限 越低。图3是来自不同供应商的HPLC级乙腈的UV光谱,尤其是在短波长范围（300190 nm） 并不相同。这可能是由于乙腈中难以去除的杂质因各溶剂供应商使用的纯化技术不同而不 同。鉴于使用UV检测器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下检测，因此大部分溶 剂供应商在上述波长范围内设立UV吸收规范。:11： cm fct色皿即科的环冋肘1商朗HFLCiJSZ：睛霍革舄注柝处的收1哄离纯座冰世辛b2.2影响UV吸收测量值的因素在测试实验中，很多因素会影响UV吸收的测量值：（1）光路距离（比色皿长）。在0.20.8AU范围内，吸光率（A）的测
12、量值误差最 小，否则吸光率的测量误差会相对大些。如使用1 cm比色皿，即使在250210 nm的短 波长范围内，乙腈的吸光率也远小于0.2 AU,因此可能产生很大的误差。根据比尔定律， 溶剂的吸光率和样品的光路距离成正比，因此增加样品池长度会使溶剂吸光率增加，使其 值进入0.20.8 AU范围内，从而减小测量误差。使用5 cm比色皿，在400190 nm扫描 范围内得到不同乙腈样品的UV光谱（如图4所示）。从图4中曲线可以发现，使用5 cm 比色皿可使乙腈在低波长的大部分UV吸光率进入0.20.8 AU范围，从而显示出数据的准 确度更高。而且，不同乙腈样品的UV吸光率的差别与使用1 cm比色皿
13、时相比更明显。鉴 于这一点，Honeywell Burdick & Jackson等一些生产商使用1 cm和5 cm两种比色皿建 立UV吸收规范。壬卜|1比色生产fflMHPLC迦年睛在（2）仪器参数。由于乙腈的吸光率非常低，仪器参数的设定要保证最佳的灵敏度和 准确度。双光路模式可以克服单光路模式中光源能量随时间变化的缺点，并且可以更方便 地扫描UV全波长范围。使用分光光度计的基线校正功能，可以去除由光源、检测器和样 品池等引入的仪器变化6。由于仪器噪声随着扫描速度的提高而增大，因此推荐使用最 大扫描速度的一半。（3）参比物。用于溶剂UV吸收测定的参比物有两种可能。试剂化学品（第9 版）使用水
14、作为参比；而中国药典使用空气作为参比。使用空气作为参比时测定的乙 腈UV吸收值低于使用水作为参比时测定的值，而且在400250 nm波长的范围内通常为负 值。这是由于空气中氧和二氧化碳的贡献使其UV吸收强于水。如图5中所示，由于参比 不同造成的UV吸收有显著不同，高达0.03 AU,所以当我们阅读供应商提供的分析报告 证书时需要了解究竟是使用水还是使用空气作为参比。用新鲜的水或者实验 统制得的超 比物。直得注 验室超纯水 新鲜水常常 气泡,这些气 验前去除，否 据的准确度。3 5用窃叼业朮作拘*tt牌到的HPucazmw UUiBl收由述门申比芭皿1推荐使HPLC级瓶装 室超纯水系 纯水作为参
15、 意的是，实 系统制得的 含有大量的 泡需要在实 则会影响数（4）氮气喷雾。为了延长溶剂的保存时间，一些HPLC溶剂供应商将惰性氮气充入溶剂。作者研究了氮气对乙腈UV吸收的影响（图6）。结果发现经过氮气喷雾，乙腈在250200 nm范围内的UV吸收显著降低。200 nm处的吸光率为0.012，是氮气喷射前的四 分之一。其原因可能是氮气在乙腈中的溶解度远小于氧气和二氧化碳。氮气喷雾减少了氧 气和二氧化碳对乙腈UV吸收的贡献。（注意：也可能是由于氧气和溶剂形成了电荷传递复合物导致了 UV吸收。） 推荐在实验中用聚四氟乙烯（PTFE）盖子将这两个池都盖住。的挥发性。由于 发性溶剂，如果 池在测试过程 么样品池中的 会进入样品室 造成吸光率读ftl-S 6ltl HPLC的 UVWfifiaUcm 比色 Mb（5）溶剂乙腈是一种挥样品池和参比中是敞开的，那乙腈蒸汽可能或参比池，结果数偏低。因此，2.3 HPLC级乙腈空白梯度洗脱规范的意义如果溶剂中的杂质水平 低于1 ppm，简单的UV光谱通常检测不到其存在1。然而, 这些痕量杂质可能在有机相和水相比例较低时在柱上富集并保留，然后当梯度过程中流动 相洗脱能力增强时被洗脱下来，从而形成鬼峰7。因此，HPLC空白梯度洗脱基线上的鬼 峰高
