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1、实验7根癌农杆菌介导的植物基因转化技术根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒(Tumorinducingplasmid),简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是TDNA区(transferredDNAregion),含致瘤基因；另一个是毒性区(Virulenceregion),在TDNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在TDNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。图1是植物表达载体pBI
2、121的DNA图谱，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素抗性选择标记基因，以B葡萄糖苷酶(Bglucuronidase,Gus)为报告基因，经pBI121转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。一、试材与用具123床等。植物材料：烟草无菌苗农杆菌与载体：农杆菌LBA4404、质粒PBI121主要仪器：超净工作台、高压灭菌锅、小型离心机、光照培养箱或培养室、恒温摇二、方法步骤1试剂的配制(1) YEB培养基：
3、牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L),蔗糖(5g/L),MgSO4(2mmol/L)pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。(2) 烟草分化培养基：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIAA(3) 烟草生根培养基：MS+0.5mg/LIAA(4) 卡那霉素(Kan)母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，一20C保存。(5) 羧苄青霉素(cb)母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，一20C保存。(6) 链霉素(Sm)母液：100mg/ml，过滤除菌，一20C保存。(7) Xglue(5溴一4氯一3吲哚一B葡萄糖醛酸)溶液(1ml)：称取0.5mgXglue,加入1
4、2滴N,N二甲酰胺(DMFA)使之完全溶解，再加入980nl磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0)、10ul铁氰化钾(5mmol/L)、10ul亚铁氰化钾(5mmol/L),搅拌混匀后加入1卩lTritonX-100、Xglue溶液应现用现配。2农杆菌培养(1)挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含100mg/LSm和50mg/LKan的YEB液体培养基中，28C,180rpm振荡培养过夜。(2) 活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。(3) 5000rpm离心5min,收集菌体，用1/2MS液体培养基悬浮至OD600=0.
5、20.5,准备感染用。3外植体的侵染及共培养(1) 取烟草无菌叶片，切成46mm的叶盘(或用打孔器制取)，叶盘外植体浸入农杆菌菌液中，感染10min20min,取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。(2) 将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d。4选择培养将共培养的外植体转移到含500mg/LCb和100mg/LKan分化培养基上，25C,光照培养。5.继代培养：每隔23周继代一次，并逐渐降低Cb的浓度至200mg/L。6生根培养：待培养筛选的抗性芽长至11.5em时，切下并转入含有200mg/LCb和75mg/LKan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。7.转基因植株的Gus基因检测(1) 从具有卡那霉素抗性的烟草植株上，剪取幼嫩叶片，放入0.25ml的小离心管中，加入适量的Xglue溶液，叶片全部浸泡在染液中，盖好盖子防止挥发。(2) 37C保温，染色2h可看到蓝色，染色过夜。(3) 依次用70%、80%、90%和100%的乙醇脱色，直至绿色褪去。(4) 观察转基因植株叶片与未转化植株叶片的颜色。三、作业和思考题1. 简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。2. 根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素。刘风珍)
