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1、H/D 交换质谱分析法在结构生物学研究中的应用袁航，刘艳，陈培燕，林东海，赵玉芬*5101520（厦门大学化学化工学院，化学生物学系，化学生物学福建省重点实验室，福建 厦门 361005）摘要：氢氘交换和质谱相结合的分析方法广泛应用于蛋白质的构象及其动力学研究，其具有样品用量少、快速、灵敏、简便的优点。本论文着重从氢氘交换的原理及相关机制；影响氢氘交换的各个因素；氢氘交换质谱法中常用质谱检测仪器，以及质谱检测分析法等四个方面进行概述。关键词：生物有机质谱；氢氘交换；结构生物学；综述H/D exchange and mass spectrometry in Structural BiologyY
2、uan Hang, Liu Yan, Chen Peiyan, Lin Donghai, Zhao Yufen(Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, Department of Chemical Biology,Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University,FuJian XiaMen 361005)Abstract: The combination of H/D exchange (HDX
3、) and mass spectrometry technology is widelyapplied to the kinetic and conformational studies of proteins. The HDX-MS method has someadvantages, such as fewer samples, fast detection and more sensitive than the traditional methods.In this review, we discussed four main contents in details, containin
4、g the principle and themechanism of the exchange, the effects on the HDX, the application of the equipments, and thespecific HDX-MS methods.Keywords: bioorganic mass spectrometry; H/D exchange; structural biology; review250 引言目前，结构生物学的研究方法主要包括 X-Ray1，NMR2和 MS3等技术。X-Ray 能够获得详细的结构信息，然而衍射效果好的蛋白质晶体不容易得到
5、，耗时长，往往事倍功半，因此这种方法具有很大的局限性4-7。NMR 和 MS 是研究结构生物学最常用的两种工具，但303540是 NMR 对浓度的要求要高于质谱 2 个数量级，同时核磁的检测受到蛋白质大小的限制，在30KDa 的条件下才能够准确测定。此外，NMR 的灵敏度、蛋白质的溶解度、分析时间的长短、独立氨基质子的分配等也是 NMR 技术的障碍8。MS 可以在 fmol 水平上准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子，具有样品消耗量少、分辨率高、准确性强、操作简便的优势，并且能够和其他的技术如液相色谱、气相色谱、毛细管电泳技术联用进行复杂样品的分离分析9。从而通过对蛋白质主链的氢氘交换来
6、调控蛋白质在溶液中的溶解度。1993 年，Zhang11等人将氢氘交换和 MS 联用能够在不改变蛋白质结构的情况来探测蛋白质的溶解度。NMR 和 H/D交换联用可以测得蛋白质特定位点的氢氘交换率，但是有些氨基上的氢原子交换速率太快，对于绝大部分的蛋白质和蛋白质之间的相互作用的研究，采用 NMR 技术还是无法做到的12-14基金项目：教育部新教师基金（200803841009）作者简介：袁航，（1987-），女，研究生，主要研究方向：生物有机质谱。通信联系人：刘艳，(1976-)，女，副教授，主要研究方向:生物有机质谱. E-mail: -1-最初在 1954 年 Havidt10 等人发现蛋白
7、质主链氨基上的氢原子能够和溶液中的 D 交换，。Mandell15等人将 MALDI-TOF MS 和 H/D 交换联合起来并将其作为研究蛋白质之间和蛋白质配体相互作用的最佳手段。近年来，氢氘交换（HDX）质谱分析法被广泛应用于蛋白质配体相互作用16-17、蛋白质结构的表征18、蛋白质动力学19-20、抗原决定部位的标记21和蛋白质稳定性22等研究领域，受到人们的广泛关注。因此，本论文着重从氢氘交换45的原理及相关机制；影响氢氘交换的各个因素；氢氘交换质谱法中常用质谱检测仪器，以及质谱检测分析法等四个方面作了简要的论述。1 氢氘交换原理及其相关机制1.1氢氘交换原理氢氘交换是指蛋白质、多肽链中
8、支链上与杂原子（N,O,S）相连的极性氢原子、氮端和505560碳端的氢原子以及主链酰胺键中氨基氢原子与氘原子的交换。在中性条件下，支链上的极性氢原子交换时间是主链氨基氢原子的 103106 倍，其交换时间太快而无法测定，所以通常所说的氢氘交换是指主链氨基上的氢与氘的交换。蛋白质、多肽链中氢可分为三类，如图 1所示。图.1 多肽链上的氢的种类Fig. 1 The types of hydrogen in the polypeptide chain图 1 中，侧链极性氢（Type I，蓝色）的交换速率非常快，影响其交换速率的因素有 pH和温度；主链氨基氢（Type II，红色）的交换受溶液条件影
9、响很大，pH 和温度的降低通常会导致交换速率的降低，该类氢常用于研究主链折叠和去折叠动力学；直接与碳相连的氢（Type III，绿色）不会发生交换，因此可以忽略。1.2氢氘交换的相关机制氢氘交换机制有 EX1、EX2、EXX、络合阳离子机制、延迟机制、盐桥机制和触发机制等，其中液相中最主要的是 EX1，EX2 机制，而气相中氢氘交换比较复杂。651.2.1EX1，EX2 机制氢氘交换的位点会受到溶剂的屏蔽作用影响，稳定氢键的存在会使交换过程中蛋白质的结构发生波动。实验发现交换动力学和多肽链的构象动力学相关23-25。在液相中，蛋白质氨基的氢氘交换涉及两种不同的反应：1）蛋白质的折叠反应，其可逆
10、性会对氢键网络造成扰动；2）活泼氨基的同位素离子交换。因此整个的氢氘交换也受这两个反应的制约。通常是70考虑两种极端的情况，也就是 EX1，EX2 交换机制，如图 2 所示26：-2-图.2 HDX 交换机制示意图。A 为 EX1 机制，B 为 EX2 机制。Fig. 2 The H/ D exchange mechanism. A: EX1; B: EX275EX1 机制（图.2 A）中，氢氘交换速率 K2 远远大于重新折叠的速率；而 EX2 机制（图.2B）中，重新折叠和内在的氢氘交换反应发生竞争，只有在发生了一部分重新折叠反应后，氢氘交换才能进行完全。EX 机制用公式表示如下式 1 所示
11、27：X HclosedKopX HopenKchExchangeKcl808590其中，Kop 和 Kcl 分别是特定交换位点的开关速率常数，Kch 为化学交换速率常数，可以表征完全未被保护的氢的交换动力学，对于氨基上的氢，某位点上 Kch 值取决于其相邻的氨基酸侧链和 pD 值 (pD=pH+0.4)28。在 pH4 时，化学交换速率受碱催化的影响，因此 Kex随着 pH 的增加而增大，因此可以依据 Kex 随 pH 的变化来判断 EX1 和 EX223。从二肽模型化合物中获得的参考数据对于任意溶剂条件下的 Kch 值的评估很有参考价值29-31。在 EX2 机制中，KclKch，整体的交
12、换速率常数为 Kex 。Kex = KopKch，则 Kop=Kop/Kcl是特定位点打开反应的速率常数，在 EX2 条件下，在交换反应未发生之前许多的位点处于打开的构象状态。相反的，在 EX1 条件下，KchKcl，在蛋白质的开放区域将会发生完全的氘标记，此时 Kex=Kop32在自然状态下，氨基 HDX 会遵循 EX2 机制，但是在蛋白质失活的条件下，交换更倾向于 EX133-37。如果某种蛋白质有两种构象，当交换速率远远大于构象转换速率时，质谱会检测到双峰（EX1）；如果结构转换速率远远大于交换速率时，只可能检测到单峰，此时采用的是 EX2 机制，如图 3 所示：从图 3 可以看出 hM
13、b 在标记时间达 2.1s 时出现双峰，这是由于 EX2 机制下其结构发生了改变，并且质量大的碎片峰逐渐升高，质量小的逐渐消失，这是由于 EX1 机制的作用。-3-95100图.3 特定时间的 aMb（apomyoglobin）（A-D）和 hMb（holomyoglobin）(E-H)的同位素交换图（灰线代表仪器的干扰线，黑线是动力学模型线）32Fig.3 Isotope exchange behavior diagrams observed for ions aMb4+（Apomyoglobin）（A-D）and hMb8+（Holomyoglobin）(E-H). The gray lines represent experimental noise, and smooth black lines are stimulated peakshapes, calculated from a kinetic model.1.2.2气相条件下的氢氘交换机制相比之下，气相条件下的氢氘交换机制则要复杂得多，Campbell 教授38就曾提出了一些机制。对于蛋白质气象条件下的 HDX，由液相中的氢氘交换类推，开放的去折叠部分的105
