NorthernBlot原理及实验方法

上传人:hs****ma 文档编号:548613540 上传时间:2022-10-04 格式:DOC 页数:6 大小:54.50KB
返回 下载 相关 举报
NorthernBlot原理及实验方法_第1页
第1页 / 共6页
NorthernBlot原理及实验方法_第2页
第2页 / 共6页
NorthernBlot原理及实验方法_第3页
第3页 / 共6页
NorthernBlot原理及实验方法_第4页
第4页 / 共6页
NorthernBlot原理及实验方法_第5页
第5页 / 共6页
点击查看更多>>
资源描述

《NorthernBlot原理及实验方法》由会员分享,可在线阅读,更多相关《NorthernBlot原理及实验方法(6页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。

1、实用文档Northern Blot 原理及实验方法发布日期:2012-9-6共阅41388 次原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳, 继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行 杂交检测。用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA )及其含 量。点击查看核酸杂交系列产品实验方法:仪器、试剂、材料(一)仪器恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV交联仪,杂交炉,恒温摇床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电 炉(或微波炉),离心管,烧杯,量筒,三角瓶,等。(二)材料总RNA样品或mRNA样品,探针模板DNA(25 ng

2、),尼龙膜(三)试剂NorthernMax Kit ( Cat. # 1940,Ambion, Inc.),琼脂糖,DEPC, X 光底片, 底片暗盒,Random Primer,dNTP Mixture,111 TBq/mmola-32PdCTP , Exo-free Kle now Fragme nt 和 10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS ,双氧 水,灭菌水等。方法与步骤1. 用具的准备:180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2 .用RNAZaP

3、去除用具表面的 RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用 DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。3 .制胶:1 .称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中,加入 32.4mlDEPC水后,微波炉 加热至琼脂糖完全熔解。60C空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水 分)2. 在通风厨中加入 3.6ml的10 * Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到 胶的边缘。注:胶的厚度不能超过 0.5cm。4 胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电

4、泳槽中,加入 1x MOPS GelRunning buffer盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml1* MOPSGel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的 buffer。)5 检查点样孔。4. RNA样品的制备在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye 和适当的EB (终浓 度为10ug/ml )。混匀后,65 C空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置 于冰上5min。5. 电泳:1. 将RNA样品小心加到点样孔中。2. 在5V/cm下跑胶(5 x 14cm )。在电泳过程中,每隔30min短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后

5、继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp )接近胶的边缘时终止电泳。3. 紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量 18S、28S、溴纷蓝到点样孔的 距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。6. 转膜1用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用 DEPC水冲洗。2 用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用 DEPC水冲洗二次。3 .连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于 塑胶屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗 水屏的适当位置。4 .盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。5. 将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过 边缘约2mm

6、,以防止漏气。6. 将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。7 .打开真空泵,使压强维持在 5058mbar ;立即将transfer buffer加到胶 面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。8. 转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10 秒,去除残余的胶和盐。9. 用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。10 .将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)12 .将膜在-20 C保存。7. 探针的制备1. 在1.5ml离心管中配制以下反

7、应液:模板 DNA(25 ng)1ulRan dom Primer2ul灭菌水11ul总体积: 14ul2. 95OC加热3分钟后,迅速放置于冰冷却 5min。3 .在离心管中按下列顺序加入以下溶液:lOXBuffer2.5uldNTP Mixture2.5ul111 TBq/mmola-32PdCTP5 ulExo-free Klenow Fragme nt1 ul4 .混匀后(25ul), 37C下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。5. 65C加热5min使酶失活。8. 探针的纯化及比活性测定:1. 准备凝胶:将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,浸泡过夜。用DEPC 水洗涤膨胀的凝

8、胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE( PH7.6 )。2 .取1ml 一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维 塞住,在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。3 .将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g 离心4分钟,凝胶压紧后,补加 Sephadex G-50凝胶悬液,重复此步直至 凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处4. 100ul STE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。5. 倒掉离心管中的溶液后,将一去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5

9、ml离心管。6. 将标记的DNA样品加入25 ul STE,取出0.5ul点样于DE8 paper 上, 其余上样于层析柱上。7. 1600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA 的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.8. 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml )。9 .预杂交:1. 将预杂交液在杂交炉中68 C预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。2. 加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb 杂交液),42 C预杂交4 hr。10 .探针变性:1 .用10 mM EDTA将探针稀释

10、10倍。2. 90 C热处理稀释后探针10min后,立即放置于冰上5min。3 .短暂离心,将溶液收集到管底。11 .杂交:1 加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液 中。2. 42 C 杂交过夜(1424hr )。杂交完后,将杂交液收集起来于-20 C保存。12 .洗膜:1 .低严紧性洗膜:加入 Low Stri nge ncy Wash Solutio n#1 (100cm2 膜面积 加入20ml洗膜溶液),室温下,摇动洗膜5min两次。2 .高严紧性洗膜: 加入 High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液),42 C摇动洗膜20min两次。13 .曝光:1 .将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间3. 将X光底片覆盖与膜上,曝光4. 冲洗X光底片,扫描记录结果。14 .去除膜上的探针:将200ml0.1%SDS (由DEPC水配制)煮沸后,将膜放入,室温下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后, 可以保存几个月。15 .杂交结果操作应该小心,但不必紧张。用于 RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须 处理以除去RNAse酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之 间不要有气泡

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 商业计划书

电脑版 |金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号