《酶联免疫ELISA使用试剂盒检测过程中值得关注问题.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶联免疫ELISA使用试剂盒检测过程中值得关注问题.doc（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最正确工作状态，应成立保护和校订仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包含移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。移液器：ELISA加样量小（20-200l），其正确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别汲取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量能否正确，一般应在5%之内；恒温箱：常常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度能否一致，同意有1的偏差；洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超出2l；人工扣板时，垫纸不湿；按期检查管孔能否拥塞；酶标仪：常常保护其光学
2、部分，防备滤光片霉变，按期检测校订，使其保持优秀的工作性能。2、试剂盒选择应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审查认同，试剂应从敏捷度、特异性、精细度、稳固性、简易性、安全性及经济性全面评论。敏捷度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大批样品中阳性检出的能力。特异性：常用交错反响率表示。含有与待测物邻近构造部份的物质可能存在交错反响，使测定结果高升，可能致使假阳性，所以交错反响是评论其质量的重点指标。精细度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时观察线性范围。正确度：经过增添回收实验进行评论。简易性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，
3、实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单了然，定量试验结果计算也应简单。安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。经济性：试剂在同样质量条件下经过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价钱比较合理。试剂评论：需要有威望确实证方法和确证的样品进行检测。3、样本前办理注意事项3.1均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机频频绞碎，混淆平均。水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适合用蒸馏水冲洗。蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，而后除掉表面的水分，取食用部分。3.2振荡提取将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，
4、使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。3.2.1振荡方式：振荡器长进行上下、来回式振荡、手摇式上下振荡。在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防备组织凝固成团，不利于提取。3.3.在用有机溶剂提取过程中，假如出现乳化现象，解决的方法有：用细头轻轻的搅拌，损坏乳化后，再重复离心。再加入适当的提取剂，从头振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。3.4浓缩因为净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或许不适合直接剖析，需要去除所有有机溶剂。即试剂盒前办理步骤中把样本在60氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。浓缩方式：氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。
5、注意：3.4.1在吹干样本以前，用甲醇冲洗针头，防备杂质扰乱。3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，防止与样本接触，防备产生交错污染。3.4.3样本吹干后应立刻取下，防止吹的时间过长，影响最后检测结果。3.4.4不一样的药物，吹干后样本的保质期不一样，倡导待样本回到室温后立刻复溶。3.5净化经过提取的待测组分中往常含有一些会扰乱试剂盒中抗原抗体反响的杂质或许是含有与待测物构造相像的杂质。将待测组分与杂质分别的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前办理方法中波及到的最常有的净化是：液液分派法。比方：用复溶液溶解干燥残留物以前先加入适当的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后假如出现
6、乳化现象，能够60水浴加热，至乳化现象消逝或减弱后，加大离心转速进行离心。实例：A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前办理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。注意：(a) 二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在基层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适当的基层吹干。(b) 在用加样器汲取基层的有机相时，正常操作常常取量不正确，此时最好用带有刻度，且刻度较正确的玻璃管来定量。(c) 上诉状况对有经验的试验员还能够经过灵巧控制加样器来控制取样的正确性。(d) 在振荡过程中要注意安全。二氯甲烷在振荡的过程中，假如离心管密封性不是很好，常常简单爆开；在进行振荡时，不要让离心管口瞄准自己或许其余人，
7、防止溅到自己或许别人身上。(e) 试剂盒在使用前充分回温很必需，如回温不充分该项目曲线受影响较显然。B、硝基呋喃代谢物检测过程中常有问题硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和 1-氨基-2-内酰脲(AHD)在检测过程中也需要同其余项目同样进行增添回收测评，此中需要注意以下几个问题。代谢物在组织中是与蛋白呈联合状态，采纳一般的有机溶剂或缓冲液，是没法提取该代谢物的。需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混淆平均后，其pH应在1-3之间，不然不利用水解代谢物
8、。在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。因为部分样本的缓冲能力不一样，所以需对其pH进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也简单出现假阳性。增添回收的几种误区：呋喃类代谢物提取过程往常分三个重点步骤：水解-衍生化-提取(1)采纳标准曲线的最大标准浓度进行增添回收。如德国拜发和我企业AOZ试剂盒中的第6个标准点4.05ppb，AMOZ试剂盒中的第6个标准点8.1ppb。因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不可以代表样本前办理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失掉了实
9、质参照价值。（ 2）完整依靠未衍生的代谢物标准品进行增添回收。因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有必定的有效期，会存在潜伏的不稳固要素，并且增添回收仅能考据衍生化和提取两个重点点，不可以考证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，所以也有必定的限制性。最好的评论方案：采纳经LC-MS-MS确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评论。这也是实验室所出数据可信度最具说服力的重点点。4、酶标剖析过程中的注意事项样本的检测是鉴于抗原抗体的反响，依据标准曲线，判断样本最后的药物含量。它要求加样的正确性和洗板的一致性。在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反响在试剂盒所示的温度下
10、进行。4.1常有加样方式A 、吸一打二B 、吸二打一在实质操作过程中，倡导用“吸二打一”用这类方式，有以下几个利处：a、加样过程中在板孔内不出现或许极少出现气泡b、提升加样速度，缩短前后样本反响的时间差。在加样的过程中还应仔细注意防止出现以下现象：A 、加样的过程中漏加或许重加；B 、加样的过程中忘掉改换吸头；C、样本的重加或许漏加；D、忘掉记录样本的加样次序。4.2常有的洗板方式A 、洗板机洗板；B 、多道孔加样器洗板；C、多孔吸头洗板；在洗板的过程中，保证每孔所加清洗液量的均一，按说明书操作，不行过多，防止溢出板孔，污染其余样本；过少，则达不到清洗的成效，简单出现曲线不行线性，花板等状况。4.3甩板迅速甩尽板孔内的液体，防备板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交错污染。4.4点头轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，并且吸水纸只好使用一次。4.5显色值得注意的是，并不是试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反响时所接触到的物件的导热度等相关，实验操作人员在加完显色液后，可依据颜色的深浅适当的延伸或许缩短显色时间。防备出现吸光值靠近或高于酶标仪的最高检测敏捷度（OD值在之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不显然或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。
