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1、细胞传代培养细胞传代培养XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1、了解动物细胞传代培养的基本原理。2、掌握动物细胞传代培养的基本操作，并对Hela细胞进行穿传代培养。二、实验原理;对于贴壁生长的细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量越来越大，逐渐会在培养瓶底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时就需要对细胞进行传代。（一）传代培养准备工作：1、紫外灯照射灭菌：实验进行前无菌室及无菌操作台紫外灯照射30分钟灭菌,关闭大灯15min后可进入2、预热培养用液：培养基、血清、胰酶使用前水浴加热至细胞生长温度3、使用物品入台肥皂洗手后，以75%酒精将
2、手消毒至手腕处,所需培养基,血清,细胞,胰酶以75%酒精棉擦拭后放入操作台边缘.4、开始实验：酒精棉消毒手和手臂,(消毒后的手不可以再碰别的东西),进入操作台（二）传代详细过程：1、配制新培养液：按照所需血清浓度配置新培养液，一般先加血清，再加培养基，然后将两者用5ml的移液管混匀。2、吸出旧培养液：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量、不同细胞等诸多因素影响3、1mL0.25胰酶消化：初次传代细胞的解离程度可以通过倒置显微镜下直接观察判断，一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度。长期传代的细胞可以通过平日观察为参考，一般以观察到瓶底细胞出现针孔样缝隙为标准
3、。4、终止消化：吸出胰酶，将3ml的新培养液加入瓶里终止消化。5、扫描式吹打：用移液管吸取培养瓶内液体，从瓶口开始，采用扫描式方法反复吹打瓶皿底壁。6、确定再培养细胞密度：确保细胞已经被全吹下来后，用移液管将细胞悬液轻轻混匀，然后吸出一定量的细胞悬液扔掉或是接种于新瓶中。7、确定再培养细胞密度：确保细胞已经被全吹下来后，用移液管将细胞悬液轻轻混匀，然后吸出一定量的细胞悬液扔掉或是接种于新瓶中。8、补加培养液：补加新培养液，使瓶内液体体积在4.5-5ml之间三、实验操作：以下是我通过学习对细胞传代培养操作步骤的介绍：1、洗手：先用肥皂洗至肘部，再用75%酒精擦洗至肘部。洗完后，实验前不得接触任何
4、物品。2、将手伸进利用UV灭菌后超净工作台，玻璃窗不得大开。3、将所有瓶样用具均用75%酒精擦拭外表面，注意要按一个方向从上往下擦。4、然后将移液管和橡胶洗耳球（插式）过火：移液管左手持拿，且不得拿在刻度以下，尖端向上倾斜，先将钝端过火，然后缓缓过至尖端，一定要按这个方式过火，以便使其中的水汽逸出。可采用旋转一次过火，或每次一面多次过火，总之要使移液管每一寸都被火灼过。橡胶洗耳球可靠近火焰吹吸3-4次。然后将二者插紧，平架在平放的镊子上，备用。同样方法过火3支。5、取一小瓶做配液瓶，瓶口瓶盖均过火。6、将1640培养液瓶瓶口过火，然后左手持瓶，右手开盖，将瓶口以及瓶盖都过火，然后移取9mL于配
5、液瓶中；同样过火，将TBD胎牛血清瓶过火，并移取1mL于配液瓶中，混匀，共10mL培养液，备用。7、将旧瓶中的旧培养液全部吸出，注意移液管不得触及细胞贴壁面，只可将其触及底部，缓缓吸出。移取10mL备用培养液注入旧瓶中，吹打细胞。各方向，每点都要吹到，平均每点吹50次。吹好后，移取5mL于新瓶中。（新瓶事先用不含TBD的1640培养液润洗，便于细胞贴壁。）8、盖好瓶盖放于37摄氏度培养箱中培养。大约3天即可长满瓶底，届时，可进行新一次分9、以上只是某些情况下的大致操作，实际操作还需结合实际。另有很多注意事项，不一一列举。四、实验现象;80%。要求：癌细胞浓度达到70%培养瓶Hela细胞镜检五、小结：通过本次实验，我了解了动物细胞传代培养的基本原理，掌握了动物细胞传代培养的基本操作，并对Hela细胞进行穿传代培养。在对实验操作的学习与掌握中进一步加深了对无菌操作重要性的认识。基本上达到了本次实验的目的与要求。
