文献阅读报告2

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1、铜绿假单胞菌的耐药机制摘要铜绿假单胞菌是1种条件致病菌，在健康人皮肤、呼吸道等部位均可存在。随着 抗生素的广泛和不合理使用导致细菌抗生素耐药性增加，其耐药机制主要涉及外膜通透性障 碍、作用靶位改变、产生灭活酶、形成生物膜和主动外排泵系统等.从而为临床治疗铜绿假 单胞菌感染提供积极可行的重要意义。关键词铜绿假单胞菌；耐药机制；8 -内酰胺酶；生物膜；主动外排泵铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)俗称绿脓杆菌，是1种革兰氏阴性菌致病 菌，在健康人皮肤、呼吸道等部位均可存在，是临床上常见的院内感染致病菌。近年来，PA 对人体的致病作用明显增加，成为一系列严重的化脓性感染

2、，尤其是支气管扩张、慢性支气 管炎、囊性肺纤维化等基础疾病继发感染的重要致病菌。随着抗生素的广泛应用，PA对临 床常用抗生素出现不同程度的耐药且耐药率呈逐年上升趋势，这已成为临床治疗最棘手的问 题，给治疗感染带来相当大的困难。PA耐药机制十分复杂，包括外膜通透性障碍、作用靶 位改变、产生灭活酶、形成生物膜和主动外排泵系统等，现综述如下：1外膜通透性障碍在阻碍抗菌剂渗透作用上，细菌细胞外膜起主要作用。一般细菌细胞膜上镶嵌有孔蛋白， 作为生命物质交换的通道，有些药物可以通过孔蛋白进入细菌内。PA的外膜由微孔蛋白孔 道组成，仅允许相对分子质量小的糖类扩散，在维持PA基本生理代谢的同时，即使小分子 水

3、溶性抗生素通过孔道的速度依然很慢，因而PA具有天然的多重耐药性倾向，疏水的抗菌 剂，如8 -内酰胺类和喹诺酮类，必须通过细菌外膜的专用水通道外膜孔蛋白(outer-membrane porin,Opr)才能进入细胞。特定Opr的缺乏可能造成相关抗菌剂的耐药。实验研究表明，抗 生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度，PA更易丢失外膜蛋白，导致多药耐 药1。如OprD2是碳青霉烯类进入PA的通道，OprD2缺失或低表达常是导致PA对碳青霉 烯类耐药的重要原因2-3,在临床使用亚胺培南治疗PA感染失败时就会有亚胺培南耐药菌 株出现，检查这些菌株的外膜蛋白常可发现OprD2缺失。实验室中筛选亚

4、胺培南耐药菌株 也证实了 OprD2在亚胺培南耐药菌株中的缺失。亚胺培南耐药菌株中转入带有编码OprD2 基因的质粒后就恢复了对亚胺培南的敏感性。OprD2缺失导致对亚胺培南耐药，而对亚胺培 南和美罗培南同时耐药的PA常在OprD2的缺失的基础上并有泵出机制的改变4。目前， 多数抗生素渗入PA的途径尚不清楚。2作用靶位的改变PA通过改变靶位青霉素结合蛋白(penicillin binding protein,PBP)和DNA拓扑异构酶 的结构，对8 -内酰胺类和喹诺酮类抗菌剂产生耐药。PBP参与合成细菌细胞壁肽聚糖，是 保持细菌细胞壁正常形态及功能的必需条件。8 -内酰胺类抗菌药与PBP结合后

5、，PBP便失 去酶的活性，使细胞壁合成受阻，最终造成细胞溶解细菌死亡。PA能改变其青霉素结合 蛋白的结构或产生一种新的青霉素结合蛋白，后者与8 -内酰胺类抗生素的亲和力减低因而 导致耐药的发生。在实验室菌株和临床分离菌中，均发现耐药PA中有PBP改变现象的存在 18，在对亚胺培南耐药的PA临床分离中，发现其耐药性与PBP的改变密切相关，并与膜 通透性改变有协同作用19。喹诺酮类抗菌药通过抑制DNA拓扑异构酶II、W，阻断DNA 的复制而产生抗菌作用。大多数氟喹诺酮类药物首先以DNA促旋酶为主要作用靶位，但研究 表明某些抗菌谱广的新一代氟喹诺酮类药物对DNA促旋酶和拓扑异构酶W均有作用。细菌编

6、码的DNA促旋酶和拓扑异构酶W的基因突变，改变了酶的结构，使药物不能与酶DNA复合物 稳定结合是细菌对喹诺酮类药物的重要耐药机制。3产生灭活酶细菌被诱导产生钝化酶，其通过修饰、水解作用破坏抗菌剂，使之转为无活性产物，是 细菌产生耐药性的最重要机制。PA可产生8 -内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、氯霉素乙酰转 移酶等，其中8 -内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶具有重要临床价值。3.18 -内酰胺酶(8 -lactamase)产生8 -内酰胺酶是PA对8 -内酰胺酶类抗生素耐药的最 重要机制。随着新的广谱8 -内酰胺酶类抗生素的广泛使用，PA可产生多种8 -内酰胺酶导 致对新的8 -内酰胺酶类抗生素耐药。2

7、010年，Bush和Jacoby更新了8 -内酰胺酶分类12， 主要包括超广谱8 -内酰胺酶(extended spectram8 -lactamase， ESBLs)、AmpC 酶、金属8 - 内酰胺酶和其他的酶类。3.1.1ESBLs ESBLs能水解青霉素、头抱菌素类抗菌剂，一般对8 -内酰胺类酶抑制剂复 合物、碳青霉烯类抗菌剂敏感。ESBLs基因主要由TEM-1、TEM-2、SHV-1基因位点突变 衍生而来。编码ESBL的绝大多数基因位于质粒上，常常通过转化、传导、结合等方式在质 粒与质粒间、质粒与染色体间不断转移，导致更多的细菌产生ESBL，并通过特异性地整合 和重组使多种耐药基因在

8、细菌的耐药质粒上群聚，致使细菌产生多重耐药。近些年的研究发 现，ESBLs基因不仅可以存在细菌质粒DNA上，而且也可以存在于细菌染色体DNA上， 这说明细菌的耐药性不仅可以通过质粒进行水平传播，也可以通过染色体基因垂直传播给子 代，这使得细菌的耐药状况变得更为复杂13。产生ESBLs细菌的耐药基因分为五类，主要 有TEM、SHV和OXA三类。亚胺培南对一般的ESBLs高度稳定，可为治疗产ESBLs耐药 菌感染的首选方案，但在治疗产ESBLsPA感染时要慎重，因为PA对亚胺培南耐药率现已 增高，因为PA在产生质粒介导的8 -内酰胺酶时可同时伴有OprD2的缺失。3.1.2产生头抱菌素C8 -内酰

9、胺酶(AmpC酶)AmpC酶是作用于头抱菌素且不被克拉维 酸所抑制的8 -内酰胺酶，又称头抱菌素酶。PA中的AmpC酶是典型的诱导酶。正常情况下 AmpC酶表达水平很低，但大量使用第3代头抱菌素等8 -内酰胺类抗菌剂后可增加表达水 平。PA主要是调节基因AmpD发生突变，产生的有缺陷的AmpD蛋白，不能与另一种调控 蛋白一AmpR蛋白结合形成复合物，AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用，引起AmpC 酶大量表达。产AmpC酶的PA对多数8 -内酰胺类抗生素、头霉素类耐药，8 -内酰胺酶抑 制剂不能抑制AmpC酶的活性，所以在治疗产AmpC酶的PA感染时，应选用碳青霉烯类、 第4代头抱菌素类抗

10、生素。3.1.3金属8 -内酰胺酶(metallo 8 -lactamase,MBL)MBL简称金属酶，能水解除单环 类以外的几乎所有8 -内酰胺类抗菌剂，使细菌对青霉素、头抱菌素和碳青霉烯类药物耐药， 耐药基因由染色体或质粒介导，并在PA和其他非发酵菌中传播，对金属螯合剂敏感，对锌 离子有依赖性。目前，MBL分为IMP、VMP、SMP和GIM型14-15。PA中编码MBL的 基因大多由质粒携带，且定位与整合子上。整合子是细菌的DAN片段，它的独特结构可捕 获外源性基因，并使之转变为功能性基因的表达单位16。因此，虽然目前报道产MBL的 PA数量仍较少，但由于整合子的传播特性使得MBL的数量正

11、在增加，随时可能引起医院 感染的暴发和流行。3.2氨基糖苷类钝化酶PA产生氨基糖苷类钝化酶是对氨基糖苷类抗生素耐药的原因 之一，钝化酶催化氨基糖苷类抗生素氨基或羟基的共价修饰，导致氨基糖苷类抗菌剂与核糖 体结合减少而不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活 17。在细胞浆内，对抗生素进行修饰的钝化酶主要有三类：氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotransferase ,APH)、氨基糖苷乙酰转移酶 (aminnoglycoside acetyltranferases ,AAC)和氨基糖苷核苷转移酶(aminnoglycoside nucle

12、otidyltransferase ,ANT)。 氨基糖苷类钝化酶常和MBL、ESBL等同时存在于细菌的转座子或整合子上，使PA表现多 重耐药并导致细菌水平间耐药的传播。3.3氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase,CAT) CAT由质粒编码使氯 霉素乙酰化而失去抗菌活性。4细菌生物膜生成细菌生物膜(biofilm ,BF)是细菌在生长过程中为了适应生存环境而形成的一种与浮游 细胞相对应的存在形式，由细菌和它所分泌的胞外多聚物组成，附着在有生命或无生命的物 体表面形成高度组织化的多细胞结构。生物膜是细菌的保护性生长方式，这种黏附定植方式 不仅有利

13、于细菌附着在某些支持物表面不易被流动液体推走，较单个或混悬的菌细胞更易于 抵抗宿主免疫细胞、免疫分子和抗菌剂的攻击，同时可增强毒力基因和耐药基因的传递。生物膜确切的生化组成仍不清楚。BF中水分含量可高达97%，除了水和细菌外，BF 还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物、细菌裂解产物等。一些 PA的生物膜主要有糖醛酸(如藻酸)和碳水化合物所组成，形成所谓胞外黏液多糖，但由 于氧气和营养物质获得等条件的不同，其组成可相差很大。胞外黏液多糖是?人的重要致病 因子，与慢性呼吸道感染密切相关，虽然抗菌剂有一定的临床疗效，但A总是难以彻底 清除。电镜观察可见病变部位有细菌生物膜形成，其

14、中藻酸盐是重要的组成部分，其可以使 细菌牢固地黏附于肺上皮细胞形成膜，不仅可抵御单核-巨噬细胞的吞噬作用，而且可以抵 御抗菌剂的杀灭作用。研究表明，PA藻酸盐的合成是由细菌alC和alD基因控制的。PA和 硅胶膜表面接触后，可以激活控制藻酸盐合成的基因组，促使细菌合成大量的藻酸盐。因此 细菌生物膜的形成是受严密基因调控的20-21.PA生物膜相关感染的难治性是多种耐药机制共同作用的结果，而细菌的耐药与其多细 胞群落聚集有关，所以破坏细菌生物膜的多细胞结构是清除细菌生物膜的主要治疗思路，目 前生物膜相关感染的治疗仍是个棘手的问题。5主动外排泵系统自20世纪80年代发现细菌的耐药与主动外排泵系统有

15、关以来，主动外排泵系统越来越 引起人们重视。PA细胞膜上得许多蛋白可将抗菌剂主动外排并与其细胞外膜的低通透性对 耐药起协同作用，在致PA多重耐药中发挥越来越重要的作用。PA细胞膜上得外排泵是导 致PA对多种抗生素表现固有或获得性多重耐药的原因。PA的主动外排系统主要由三部分 组成：一是外膜通道蛋白，如OprM、OprJ、OprN等，形成门通道，使药物排出到菌体外； 二是内膜蛋白，如MexB、MexD、MexF等为主要的主动外排蛋白，具有识别药物的作用， 但不具有特异性；三是连结蛋白或辅助蛋白，如MexA、MexC、MexE等，能连接内、外膜 蛋白，与他们一起形成了主动外排系统并开口于外膜的复合

16、体，是药物直接泵出到菌体外。 在 PA 细胞膜上有 7 种外排系统:MexAB-OprM、MexXY-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、 MexJk-OprM、MexGHI-OpmD和 MexVM- OprM5-6,而在PA中对耐药较为重要的是前4 种外排泵(MexAB-OprM、MexXY-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN)7,外排系统能有 效的排除多粘菌素外所有的抗菌剂，从而导致多重耐药。其中，PA MexAB-OprM是迄今为 止最具有临床意义的药物主动外排系统，在PA的多重耐药中起着最为重要的作用。MexAB-OprM在所知的多药外排泵中具有最广的底物特异性，它会造成PA对多种类型的抗 生素天然耐药，主动外排0-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类等 抗生素，但碳青霉烯中亚胺培南、羧苄西林等却不是其底物8.有研究显示，随着抗生素及 消毒剂等诱导剂的广泛使用，外排泵底物越来