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1、3.2 蛋白质分子结构与功能的关系 了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使其功能的基础。蛋白质功能总是跟蛋白质与其它分子相互作用相联系，被蛋白质可逆结合的其它分子称为配体。蛋白质配体相互作用的瞬时性质对生命至关重要，因为它允许生物体在内、外环境变化时，能迅速、可逆地作出反应。蛋白质上的配体结合部位与配体在大小、形状、电荷以及疏水或亲水性质等方面都是互补的。 3.2.1细胞色素的分子进化1、细胞色素C的一级结构的种属差异和分子进化从细菌到人，一切需氧的生物体内，都有细胞色素C的存在。细胞色素C是一个具有104112个氨基酸组成的多肽分子，是一种在需氧细胞的代谢中担任重要角色的蛋白质，在蛋白质一
2、级结构的种属差异研究的蛋白质中占有最重要的地位。这是因为，细胞色素C分子的结构比较简单，大小合适，容易纯化结晶，结构测定也比较容易，因此，是研究分子进化的最好材料。现在已对不同种属来源的细胞色素C，从一级结构，三维结构以及功能等各方面进行了系统的研究。存在部位与作用：细胞色素C存在于细胞的线粒体中，是参加生物氧化的一种电子传递体，大约在十亿年前，生物进化到需要氧的阶段，即出现了生物氧化过程，于是就产生了细胞色素C，因此，细胞色素C是生物界广泛存在的一种古老的蛋白质。细胞色素的残基数：脊椎动物的细胞色素C由104个氨基酸残基组成。少数103个，昆虫108个氨基酸残基，植物111114个残基，一般
3、为112个氨基酸残基。不同生物与人的CytC的AA差异数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44以人的细胞色素C为标准进行比较，发现人与黑猩猩的细胞色素C的一级结构完全相同，与恒河猴只相差一个残基，与马相差12个残基。从细胞色素C的一级结构中的氨基酸残基的改变数的多少可以看出，生物从原核到真核，从单细胞生物到多细胞生物，从低等生物到高等生物的进化规律，反映了种属之间的亲缘关系。 2细胞色素C三级结构活性部位的保守性同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能
4、的蛋白质称同源蛋白质，指由共同的祖先蛋白分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关并在结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。在进化过程中一级结构始终保持不变的氨基酸残基称为守恒氨基酸残基，在不同物种的细胞色素C一级结构中，则有35个位置的氨基酸残基是完全不变的，因此叫做不变残基或叫做守恒残基，这些守恒残基分散在多肽链的各个部位，在分子进化过程中，细胞色素C的一级结构虽然有很大的变化，但三级结构基本上保持不变。三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位的氨基酸残基及其三维排布，均不会发生改变。这是蛋白质发挥其生物功能的基本条件。蛋白质分子的三维结构不能因为变异而受到严重影响。由于分子内部的氨基
5、酸残基通常对维系三维结构比较重要，因此，变异较多地发生在蛋白质分子表面上。血红素是细胞色素C分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。其它不变的氨基酸残基有的是为了保证血红素在蛋白质分子中正确的立体位置，保持多肽的构象形成一个疏水性的狭缝，狭缝的结构严格地决定着整个细胞色素C分子的三维结构，不同物种的细胞色素C的狭缝区域，其疏水性残基一般是保守的，或者是可以保守性取代的残基，脯氨酸在拐角处，甘氨酸没有侧链，体积小，也在拐角处。保守性取代：指化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象，例如：Leu 与Ile、 Phe 与Tyr、 Asp与Glu之间都能互相替换。Rossman等人研究了各种
6、蛋白质结构与功能的相似性之后指出，在生物进化的过程中，蛋白质的二级结构、超二级结构以及三级结构存在很大的保守性，同源蛋白质的一级结构允许有种属差异，但生物功能所要求的特定构象不能改变。不同生物的细胞色素C的氨基酸组成是有一些置换，但它们的生理功能却是相同的。3系统树：根据蛋白质中氨基酸残基的变化情况与古生物学测定生物进化年代相比较，可以发现各种蛋白质分子进化都有其本身的进化速率，称为单位进化周期。单位进化周期是指蛋白质在进化过程中每一个残基上的变异所需时间。据此分析出细胞色素C的单位进化周期是2640万年，不同蛋白质的单位进化周期是不同的，血红蛋白仅为580万年。图3-34 生物进化的系统树
7、系统树是用计算机分析细胞色素C序列并找出连接分支的最小残基数的方法构建起来的，用其它计算机方法可推断出系统树分支点处的潜在祖先序列。根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进化过程，还可以粗略估计现存的各类物种的分支时间 (图3-34) 。 3.2.2 肌红蛋白的结构与功能 3.2.2.1 肌红蛋白的分子结构 肌红蛋白(myoglobin)存在于肌肉中，能贮藏O2，供生物氧化之用。抹香鲸肌红蛋白是第一个经X-射线晶体衍射测定出精确三维结构的球蛋白，它的分子包括一条153个氨基酸残基组成的多肽链和一个血红素，其多肽链的氨基酸序列。图3-35肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白多肽链中的残基7
8、580处于-螺旋中，其余为无规卷曲，整个肽链有8个长短不一的螺旋段，即A.B.C.D.E.F.G.H，在侧链基团相互作用下盘曲形成4.3nm3.5nm2.3nm扁园的球体。绝大多数亲水残基分布在分子表面，使肌红蛋白可溶于水；疏水残基则埋藏于分子内部，血红素结合于E与F螺旋之间的裂隙内(图3-35)。 肌红蛋白分子表面有一狭缝，E螺旋和F螺旋位于狭缝两侧，形成一个疏水微环境。肌红蛋白的辅基血红素就结合在这个狭缝内。血红素的侧链丙酸基伸到分子表面，在生理pH下，它们带负电荷，Fe2+与卟啉环四个吡咯N原子配位(图3-36A)，F8-His残基咪唑环N-3占据第五个配位位置，Fe2+在邻接His(F
9、8)一侧，距离卟啉平面约0.03nm。O2占据第六配位位置，在卟啉平面另一侧与血红素可逆地结合。脱氧肌红蛋白中第六配位空置：而在高铁(Fe3+)肌红蛋白中H2O占据这个位置。在狭缝另一边E7His并未与血红素结合，称为远侧组氨酸，靠近第六配位位置(图3-36B)。图3-36血红素辅基的结构 肌红蛋白由3个外显子编码：外显子编码1至30(NA1到B2)，外显子编码31至105(B3至G6)，外显子编码106至153(G7至HC5)（图3-32）。研究表明，39至139(C4到H14)的片段与血红素结合关系密切。有人用蛋白酶从脱辅基肌红蛋白N-端和C-端各切去一段，制备出相当于32至139的多肽，
10、加入血红素后构成微型肌红蛋白，在体外系统能可逆地与O2结合，与天然肌红蛋白相似。就氧合功能而言，1-31和140-153贡献不大，但不排除这些片段在稳定分子结构、促进合成、折叠和运输以及种系发生等方面可能的作用。图3-37 血红蛋白-亚基的形成 3.2.2.2 肌红蛋白的功能 血红素在水中可以短暂地氧合，然后形成血红素-O2-血红素夹层中间物，很快产生不能氧合的高铁血红素。虽然肌红蛋白中真正与O2结合的是血红素，但是肽链起着围篱作用。由于血红素结合在肽链绕成的疏水狭缝中，远侧His的位阻效应防止了夹层复合物的形成，避免了Fe2+氧化或流失，使血红素可以长时间可逆的氧合-放氧，完成O2载体的使命
11、。同样是血红素辅基，在细胞色素中它是电子载体，在过氧化氢酶中参与过氧化氢分解为水和氧的催化过程。可见辅基的功能在一定程度上依赖于它所结合的多肽链提供的微环境。 为了给肌红蛋白肽链的围篱作用提供实验支持，James和Collman合成了围篱铁卟啉复合物，在铁卟啉平面一侧，有一个咪唑衍生物占据Fe2+第五个配位位置，另一侧有疏水侧链基团形成保护O2结合的围篱(图3-38)，它对O2的亲和力与肌红蛋白相仿。 CO是许多含碳物质不完全燃烧的产物，也是血红素在体内降解的产物之一。游离血红素对CO的亲和力比对O2的亲和力大25000倍：而肌红蛋白对CO的亲和力仅比对O2的亲和力大200倍。这是因为游离血红
12、素与CO结合时，C-Fe2+键与CO键在一条直线上；而血红素与O2结合时Fe2+-O键与O=O键之间形成121的夹角。在肌红蛋白中，远侧His(E7)的存在对其与CO的结合显然会产生更大的位阻效应，结果大大降低了对CO的亲和力和CO中毒的危险，保证在生理条件下肌红蛋白能有效地履行贮藏和输送O2的功能(图1.37)。脱氧肌红蛋白中-螺旋含量约60，三维结构比较松散，稳定性下降。与血红素结合后，构象发生变化，-螺旋含量恢复至75，分子结构比较紧凑，稳定性也明显提高。这说明血红素辅基对肽链折叠也有影响。 3.2.3 血红蛋白的结构与功能 血红蛋白(hemoglobin, Hb)存在于脊椎动物红细胞中
13、，是运输O2和CO2的工具。Hb是第一个得到X-射线衍射结构分析初步结果的蛋白质，还是第一个与生理功能相联系的蛋白质。从异常血红蛋白一级结构研究中提出了分子病的概念，从Hb与O2结合中发现了协同效应。从而成为迄今认识蛋白质结构与功能关系最好的范例。 3.2.3.1 血红蛋白分子结构 血红蛋白由四个亚基组成(22)，每个亚基含一条多肽链和1个血红素辅基。亚基多肽有141个氨基酸残基，亚基多肽链有146个氨基酸残基，二者有60个相同，约占42，其中有23个残基与Mb相同。Hb的亚基与Mb的氨基酸序列虽有明显不同，但血红素结合部却非常保守，而且它们的二、三级结构也十分相似，仔细对比也有一些差异(表3-5)。表3-5 血红蛋白-和-链与肌红蛋白二、三级结构的异同肽链区段肌红蛋白（Mb）-链（）-链（）A螺旋AB非螺旋B螺旋BC螺旋C螺旋CD螺旋D螺旋E螺旋EF螺旋F螺旋FG螺旋G螺旋GH螺旋H螺旋HC螺旋残基总数-螺旋非螺旋-螺旋非螺旋-螺旋无规卷曲-螺旋-螺旋无规卷曲-螺旋无规卷曲-螺旋无规卷曲-螺旋基(24个残基)含5个残基153=MbA16-B1不同=Mb=Mb有310螺旋都不同于Mb不存在无规卷曲EF25不同于Mb=Mb=MbG13为310螺旋Mb含20个残基含3个残基141=Mb少2个残基=Mb=Mb有310螺旋CD57不同于Mb=MbE1820为无规卷曲
