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1、 基于分子生物学的长江口外海域水中微生物鉴定基于分子子生物学学的长江江口外海海域中微微生物鉴鉴定摘要：作作为国家家卫星海海洋中心心组成部部分，本本论文主主要是初初步查明明秋季长长江口外外海域海海洋悬浮浮物中的的微生物物种类。220088年秋季季，我们们在长江江口外海海域采集集的海洋洋悬浮物物样品，利利用对海海洋微生生物166SrRRNA基基因的直直接扩增增，克隆隆和测序序，从而而鉴定微微生物的的种类。通通过开展展本研究究，我们们希望能能初步查查明长江江口外海海域海洋洋悬浮物物中的微微生物种种类，为建立立海洋微微生物分分子生物物学检测测的技术术体系打打下一定定的基础础。关键词：海洋微微生物，种种
2、类鉴定定，166SrRRNA，海海洋悬浮浮物Idenntifficaatioons of Miccrooorgaanissm ffromm thhe OOutssidee waaterrs oof CChanngjiianggRivver Esttuarry bby MMoleecullar Bioologgy TTechhniqquessAbsttracct:BBeinng aas aa maajorr paart of SattellliteeOceean Cennterr off Chhinaa , thiis sstuddy iis ttryiing to priimarrilyy i
3、nnvesstiggatee thhe mmicrroorrgannismm sppeciies in thee Suuspeendeed ssoliids froom tthe Outtsiddewaaterrs oof CChanngjiiangg Riiverr Esstuaary。 In ffalll inn 20008, wee coolleecteed SSusppendded sollidss saamplles froom tthe bioologgy iinveestiigattionn sppot 24 of SattellliteeOceean Cennterr off
4、Chhinaa, tthenn iddenttifiied thee maarinne mmicrroorrgannismm sppeciies by usiing dirrectt ammpliificcatiionss off 166S rrRNAA geene froom mmariine miccrooorgaanissm, clooninng aand seqquenncinng ttechhniqquess. IIn tthiss sttudyy, wwe hhopee too iddenttifyy thhe mmariine orgganiism speeciees iin s
5、sediimennt ffromm thhe CChinnaEaastSSea neaar tto SShannghaai, whiich couuld proovidde bbasiis ffor thee esstabblisshmeentss off maarinne mmicrroorrgannismm moolecculaar ddeteectiion tecchniiquee syysteem.Key worrds:Marrinee miicrooorgganiism, sppeciies ideentiificcatiion, 166SrRRNA, maarinne ssedii
6、mennts基于分子子生物学学的长江江口外海海域中微微生物鉴鉴定DNA电电泳迁移移率的对对数与凝凝胶浓度度成线性性关系。凝凝胶浓度度的选择择取决于于DNAA分子的的大小。分分离小于于0.55kb的的DNAA片段所所需胶浓浓度是11.2-1.55%,分分离大于于10kkb的DDNA分分子所需需胶浓度度为0.3-00.7%, DDNA片片段大小小间于两两者之间间则所需需胶浓度度为0.8-11.0%。 电源电压压 在低低电压时时,线状状DNAA片段的的迁移速速率与所所加电压压成正比比。但是是随着电电场强度度的增加加，不同同分子量量的DNNA片段段的迁移移率将以以不同的的幅度增增长,片片段越大大,因场
7、场强升高高引起的的迁移率率升高幅幅度也越越大,因因此电压压增加，琼琼脂糖凝凝胶的有有效分离离范围将将缩小。要要使大于于2kbb的DNNA片段段的分辨辨率达到到最大,所加电电压不得得超过55v/ccm。 离子强度度影响 电泳泳缓冲液液的组成成及其离离子强度度影响DDNA的的电泳迁迁移率。在在没有离离子存在在时(如如误用蒸蒸馏水配配制凝胶胶),电电导率最最小,DDNA几几乎不移移动,在在高离子子强度的的缓冲液液中(如如误加110电电泳缓冲冲液),则电导导很高并并明显产产热,严严重时会会引起凝凝胶熔化化或DNNA变性性。 对于于天然的的双链DDNA,常用的的几种电电泳缓冲冲液有TTAE含EDDTA
8、(pHH8.00)和TTriss-乙酸酸,TTBE(Triis-硼硼酸和EEDTAA),TTPE(Triis-磷磷酸和EEDTAA),一一般配制制成浓缩缩母液,储于室室温.三、 琼琼脂糖凝凝胶的制制备 1、 取5TBEE缓冲液液20mml加水水至2000mll,配制制成0.5TTBE稀稀释缓冲冲液,待待用。 2、 胶液的的制备：称取00.4gg琼脂糖糖,置于于2000ml锥锥形瓶中中,加入入50mml 00.5TBEE稀释缓缓冲液,放入微微波炉里里(或电电炉上)加热至至琼脂糖糖全部熔熔化,取取出摇匀匀,此为为0.88琼脂脂糖凝胶胶液。加加热过程程中要不不时摇动动,使附附于瓶壁壁上的琼琼脂糖颗颗
9、粒进入入溶液。加加热时应应盖上封封口膜,以减少少水份蒸蒸发。 3、 胶板的的制备：将有机机玻璃胶胶槽两端端分别用用橡皮膏膏(宽约约1cmm)紧密密封住。将将封好的的胶槽置置于水平平支持物物上,插插上样品品梳子,注意观观察梳子子齿下缘缘应与胶胶槽底面面保持11mm左左右的间间隙。 向冷却却至500-600的琼脂脂糖胶液液中加入入溴化乙乙锭(EEB)溶溶液使其其终浓度度为0.5gg /mml(也也可不把把EB加加入凝胶胶中,而而是电泳泳后再用用0.55g/ml的的EB溶溶液浸泡泡染色)。用移移液器吸吸取少量量融化的的琼脂糖糖凝胶封封橡皮膏膏内侧,待琼脂脂糖溶液液凝固后后将剩余余的琼脂脂糖小心心地倒
10、入入胶槽内内,使胶胶液形成成均匀的的胶层。倒倒胶时的的温度不不可太低低,否则则凝固不不均匀,速度也也不可太太快,否否则容易易出现气气泡。待待胶完全全凝固后后拨出梳梳子,注注意不要要损伤梳梳底部的的凝胶,然后向向槽内加加入0.5TTBE稀稀释缓冲冲液至液液面恰好好没过胶胶板上表表面。因因边缘效效应样品品槽附近近会有一一些隆起起,阻碍碍缓冲液液进入样样品槽中中,所以以要注意意保证样样品槽中中应注满满缓冲液液。 4.微生生物种类类的鉴定定方法4.1微微生物的的鉴定技技术分类类分类鉴定定方法包包括表型型鉴定法法和分子子遗传学学鉴定法法两大类类,分成4个水平平：细菌菌形态和和生理生生化水平平、细胞胞组分
11、水水平、蛋蛋白质水水平和核核酸水平平。4.1.1表型型鉴定法法它是对前前3个水平平的鉴定定,包括常常规鉴定定法、数数值分类类鉴定法法和化学学分类鉴鉴定法。（1）细细菌常规规鉴定法法：它是是细菌形形态和生生理生化化水平及及蛋白质质水平的的鉴定,前者是是最经典典、最常常用的分分类鉴定定指标,也是现现代化分分类鉴定定的依据据,后者包包括免疫疫诊断技技术、蛋蛋白质图图谱分析析和氨基基酸序列列分析等等。(2)细细菌的数数值分类类和自动动化鉴定定：它应应用大量量已知菌菌对相关关生化试试验反应应出现的的频率得得出数据据进行分分析,优化组组合数110项生生理生化化指标集集合成套套试剂,根据相相似系数数大小判判
12、断细菌菌种属间间的亲源源性。自自动化微微生物鉴鉴定系统统即采用用数值分分类原理理。微生生物数值值分类鉴鉴定集数数学、电电子、信信息及自自动分析析技术于于一体,具有系系统化、标标准化、微微量化和和简易化化等优点点,采用商商品化的的鉴定测测试卡,将未知知菌鉴定定到属、种种、亚种种或生物物型,可对不不同来源源的临床床标本进进行针对对性鉴定定,所得结结果以数数字方式式表达,与数据据库数据据(手册或或软件)对比得得出鉴定定结果。(3)化化学分类类鉴定法法：它主主要通过过细菌细细胞壁化化学成分分即氨基基酸和糖糖的分析析进行分分类鉴定定,属的分分类主要要测定各各种氨基基酸组分分,种的鉴鉴定主要要是对糖糖的分
13、析析.另外外,还有有全细胞胞水解液液糖型分分析、脂脂肪酸分分析、磷磷酸类脂脂成分分分析、枝枝菌酸分分析、醌醌类分析析和光合合色素成成分分析析等,常使用用红外光光谱、气气相色谱谱、高效效液相色色谱和质质谱等新新技术。4.1.2.分子遗遗传学分分类鉴定定法分子遗传传学鉴定定法是核核酸水平平的鉴定定,对细菌菌染色体体或质粒粒DNAA进行分分析,包括G+Cmoll%含量测测定、核核酸杂交交、PCCR 技技术、116SrrRNAA和1623SSrRNNA序列列分析、全全基因组组测序等等,此类方方法使细细菌种属属定位和和亲源关关系判别别由表型型特征深深化为基基因型鉴鉴定。随着分子子生物学学技术的的发展，分
14、子遗传学分类鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的主要手段，其鉴定结果更具有说服力。下面我们主要对16SrRNA序列分析进行详细介绍。4.216SSrRNNA序列列分析4.2.116SrRNNA 的的结构与与性质16SrrRNAA为原核核生物核核糖体中中一种核核糖体RRNA。目目前,在细菌菌的系统统分类学学研究中中最有用用的和最最常用的的分子钟钟是rRRNA,其种类类少,含量大大(约占细细菌RNNA含量量的800%),分子大大小适中中,存在于于所有的的生物中中,特别是是其进化化具有良良好的时时钟性质质,在结构构与功能能上具有有高度的的保守性性,素有“细菌化化石”之称。核糖体是是细菌唯唯一的细细胞器,是蛋
15、白白质合成成的场所所,它的RNNA含有有3种类型型:23SS、16SS和5SrrRNAA,它们分分别含有有的核苷苷酸约229000、15440和1200个。600年代末末,Wooese开始始采用寡寡核苷酸酸编目法法对生物物进行分分类,他通过过比较各各类生物物细胞的的核糖体体RNAA(rRRNA)特征序序列,认为166SrRRNA及及其类似似的rRRNA基基因序列列作为生生物系统统发育指指标最为为合适。其其主要依依据是:它们为为细胞所所共有,其功能能同源且且最为古古老既含含有保守守序列又又含可变变序列,分子大大小适合合操作:它的序序列变化化与进化化距离相相适应(陈文新新19998)。5SrrRNAA虽易分分析,但由于于核苷酸酸少,没有足足够的遗遗传信息息用于分分类研究究。而223SrrRNAA含有的的核苷酸酸数几乎乎是166SrRRNA的的两倍,分析较较困难。16SrRNA的相对分子量适中,作为研究对象较理想。细胞核糖糖体RNNA可将将遗传信信息得以以表达,转译成成蛋白质质,因此可可以想象象这些分分子具有有作为种种系发生生的指示示所必不不可少的的性质。在在相当长长的进化化过程中中,rRRNA分分子的功功能几乎乎保持恒恒定,而且其其分子排排列顺序序有些部部位变化化非常缓缓慢,以致保保留了
