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1、国的溶菌酶的应用与发展溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于Nicolle1907年发布的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年Fleming等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因此被命名为溶菌酶1。1965年,英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究剖析,第一个完整弄清了溶菌酶的立体结构2。此后代们发现溶菌酶宽泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各样微生物中,此中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不损坏其余组织,且自己无毒无害,因此它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药
2、制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用围和应用量还比较有限,但能够估计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品增添剂。溶菌酶的结构特色和抗菌作用体制结构特色与复杂性大部分鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸构成的碱性球状蛋白,相对分子量在1400018000。其等电点可达107,存在4个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为4550。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长久保留。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被损坏,但在酸性溶液中其化学性质稳固,热稳固性很强,在pH47时,100下办理1min酶仍保持优秀的活性,在pH3时,100加热办理45min还能保
3、持活性3。溶菌酶在水溶液中6215下,保持30min则完整失活,在2015%的乙醇中,在6215下保持20min而不失活4。王玮等5研究表示。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳固性均跟着醇浓度的增大而提升。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸构成,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,因为工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,所以一定采纳一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等7研究发现,当酶浓度较低时,017mol/L的盐酸胍即可使溶菌酶完整复性。别的,溶菌酶和其它酶拥有相像的性质,Karuppiah等8研究表示,向复性溶液中加入适当的-环糊精
4、,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80%。董晓燕等9利用-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适合盐酸胍浓度下,溶菌酶可完整复性。王彦等利用离子互换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其余盐类时,脲浓度为210mol/L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提升溶菌酶的复性回收率。溶菌酶的抗菌作用体制目前已知的几种溶菌酶有:-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶-1,3、-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶11。参加细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大概可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。-N-乙酰己糖胺酶、-1,3、1,6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂
5、,损坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以-N-乙酰己糖胺酶为例,-N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的-1,4糖苷键,使肽聚糖分子发生断裂,使细胞壁外双侧浸透压失衡,造成细胞破碎,致使微生物因细胞壁溶解而被杀死12氏阳性菌因为二者细胞壁中肽聚糖含量不一样而存在差异,G+细胞壁含80%肽聚糖,而G-细胞壁只有在壁层含有少许肽聚糖。结晶法是传统的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制备过程不是很烦杂。起初MayerAbraham等研究并利用此法,于1937年获取结晶状物质13,1945年Alderton等
6、提出直接结晶法制备溶菌酶的方法14。景芝等15对传统结晶法做出了改良,经过调整透析液pH值,加入磷酸盐,再调整其pH值,而后离心去除杂质获取纯化液,使产率提高,活性增添。离子互换层析法离子互换层析法是依据各样蛋白质所带电荷数的不一样而与离子互换剂之间结协力的差异,从而将不一样蛋白质分别的技术。该法应用于溶菌酶分别始于80年月,因为其操作简易、高效、成本低、可自动化连续操作的长处,向来以来都是溶菌酶生产的常用方法16。目前外国常用的离子互换剂有Duolite-464、724、732弱酸性阳离子互换树脂、D903、201大孔离子互换树脂、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基琼脂糖等17。宋宏新等18采纳
7、724树脂,装柱后抽提液迟缓流入柱中,用缓冲液清洗，再用硫酸铵洗脱,结果表示724树脂的吸附率达到8315%。因为Duolite-464特别合适于连续自动化操作,所以利用它来分别纯化溶菌酶,可获得较高的产率。如LiChan等19用Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分别溶菌酶,使溶菌酶的回收率达90%95 %。亲和层析法亲和层析法是依据酶与作用底物的特异性亲和能力,利用酶分子特有的专一性联合位点或结构性质的分别方法20。它的应用始于上世纪70年,因为底物能够专一性与溶菌酶联合,从而与其余蛋白分别,是一种高效的分别方法。目前利用亲和层析法分别溶菌酶的报导很多,如HeLZ等21采纳多步亲和
8、层析法分别纯化溶菌酶,结果表示,利用三亲和过滤系统从原猜中纯化溶菌酶,与一步法对比产率从61%提升到96%。超滤超滤是一种新兴分别纯化技术,利用控制超滤膜孔径大小来滤过杂质,水及小分子物质能够经过,从而获取产物。在反渗析及浓缩等工艺中宽泛应用,同时在蛋白质分别中应用也开始盛行。与传统生化分别技术对比,它的长处是产品的产出量高、杂质少、纯度相对较高。在2000年,GhoshR等22采纳小型的中空纤维超滤系统(30kDaMWCO,聚砜膜)从蛋清干粉中分别溶菌酶,溶菌酶选择性透过膜,而其余大分子蛋白质被膜所截留。溶菌酶的粗提液经过超滤技术后,有时部分杂质如无机离子等未能所有除掉若将超滤与结晶法,或是
9、与离子互换法等联合将获得精制溶菌酶。邹明丽等23报导,超滤浓缩溶菌酶经CM-SepharoseFF阳离子互换柱后,纯度提升2119倍。灏等24研究表示,将磷酸盐缓冲液稀释10倍,在24MPa下均质,利用截留相对分子质量为30000的聚醚砜(PES)膜进行超,溶菌酶制品活力达到14610u/mg溶菌酶活性的测定目前,外国对溶菌酶活性的测定方法,主要有比浊法、紫外分光光度法、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等,但上述各样方法中均存在必定的弊端,如比浊法扰乱要素多,重复性差,对单个样品测定速度快,比色法操作简单但偏差较大,所以,各样方法都在不断改进中。传统方法测定溶菌酶活性时要将溶微球菌
10、制成冻干粉,此过程不单步骤烦杂并且易造成细菌大批死亡,影响结果。玉萍等向溶壁微球菌直接加保护剂(20%的甘油)置于一般采纳了近似的方法。采纳聚苯乙烯微量反响板,成立了微量迅速比浊检测溶菌酶的方法,使标本用量减少,反响时间缩短,敏捷度较好。最近几年来,很多报导采纳标志乙二醇化几丁冰箱冷冻,使用时解冻,读第1min的吸光度值和第2min的吸光度值即可。使溶菌酶的测定方法更为节俭高效,正确性又好。溶菌酶在食品、生物医药等工业中的应用溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠被消化和汲取,对人体无迫害作用,是一种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。因为溶菌酶拥有优秀的理化特征,拥有必定的保健作用,如在
11、化妆品顶用可除去粉刺,使皮肤滑嫩,促使皮肤的新代谢;有止血,促使组织重生的作用,如在牙膏中增添可防备牙龈出血、保护牙龈并拥有杀菌作用。所以溶菌酶的应用领域特别宽泛,在食品、医药、生物工程等方面都拥有很大的应用远景。别的,溶菌酶除作为医药原资料外,仅在食品防腐、加强方面市场就比较可观,如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。跟着对溶菌酶的研究的深入和应用产品的不断开发,溶菌酶一旦被人们认识接受,其对市场的据有率将大幅提升。溶菌酶在食品中的应用溶菌酶在乳制品中的应用人乳与牛乳的最大差异之一在于溶菌酶的含量,在欧洲溶菌酶已经广泛用于婴儿食品增添剂,将必定量的溶菌酶增添到牛乳及其制品中,使牛乳人乳
12、化,能够加强血清灭菌蛋白,-球蛋白等防守因子,克制肠道中腐败性细菌的增殖,加强婴儿对病菌的抵挡力。所以,在牛乳或奶粉中增添必定量溶菌酶,不只防腐,并且加强营养,有益于婴儿健康成长。别的,在奶酪家产溶菌酶也被宽泛使用,如在干酪生产中代替硝酸盐,加入01001%的溶菌酶,可防备干酪产气,保持香味物质丁酸。德国于1995年11月22日公布了奶酪法例,同意使用溶菌酶来阻挡在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所惹起的胀气现象。溶菌酶在肉制品中的应用低温肉制品因为口味鲜嫩,营养丰富,获取花费者的喜欢。但因为肉类冷藏的温度,其实不可以完全杀死微生物或克制其生长,因此保鲜期短,不可以知足花费者需求。溶菌酶自己无毒
13、、无害,可代替如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂增添到肉制品中,能有效延伸食品保质期。采纳0105%溶菌酶和0105%Nisin混淆液保鲜猪肉,4下可保鲜12d,真空包装保鲜期可达24d。在此基础上增添了18%NaCl和415%葡萄糖构成复合保鲜剂,用于小包装切割冷却肉的保鲜,保质期显然提升。相同,曾友明等将溶菌酶与Nisin、复合磷酸盐、茶多酚、酪朊酸钠构成复合保鲜剂与鲜肉混淆,制成盐水火腿,其保质期可达3个月。同时,溶菌酶在红肠的加工,延伸其货架期方面的报导也特别多。整体上溶菌酶在肉制品上的保鲜作用已经获取认同,并且获得了许多的进展,各样有关工作也在宽泛睁开。溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用研
14、究采纳0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和3%的食盐溶液中将海产品或水产品浸渍5min,沥干水分,常温下保留9d后无异味、无色彩变化溶菌酶的使用,极大提升了海产品或水产品的保鲜期,对其储藏运输等带来了很大的方便。溶菌酶在低度酒及饮猜中的应用在低度酒中增添溶菌酶不单对酒的风味无任何不良影响,还可防备产酸菌生长,是低度酒优秀的防腐剂。在日本清酒部分微生物不可以生计,但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长，并产酸使酒发臭,增添溶菌酶后火落菌被有效克制,成功取代水酸作防腐剂用于清酒中，向葡萄酒中加入必定量的溶菌酶,能够大大减少SO2的使用量,减小了SO2使用过多可能对人体造成的迫害作用。溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用跟着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不行少的工具酶,用以制造和提取菌体的活性物质如核酸,酶及活性多肽等利用其专一性水解细胞壁的特色,有助于人们对细胞壁细微结构的认识,为我们深入研究细胞壁的结构打下了坚固的基础,同时作为是一种重要的破壁酶,在原生质体的制备方面供给了新的方法,所以溶菌酶被宽泛应用于生物技术、生物工程中。溶菌酶在抗菌消炎、
