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1、种子实验手册一、种子样品的抽取（1）四分法 将种子均匀地倒在光滑清洁的桌面上，略成正方形。把种子充分混拌均匀，然后将种子铺成正方形，大粒种子厚度不超过10cm，中粒种子厚度不超过5cm，小粒种子厚度不超过3cm，用分样板沿对角线将种子分成四个三角形，将对顶的两个三角形的种子装入容器中，取余下的两个对顶三角形种子两次混合，按前法继续分取，直至多于送检样品数量为止。二、种子生物学特性测定1、种子净度的测定目前，净度的分析主要以手工操作为主，常用仪器为手持放大镜、筛子和吹风机等。净度测定时，关键是准确地判断出纯净种子、废种子及夹杂物三种成分。具体方法是：将净度测定样品倒在玻璃板上或桌面上，仔细观察并
2、区分出纯净种子、废种子及夹杂物三种成分。并分别称重，将结果记录附表。分类的标准如下：纯净种子：完整的、没有受伤害的、发育正常的种子；发育不完全的种子和不能识别的空粒；虽已破口或发芽，但仍具有发芽能力的种子。带翅的种子中，凡加工时种翅容易脱落的，其纯净种子是指除去种翅的种子；凡加工时种翅不易脱落的，则不必除去，其纯净种子包括留在种子上的种翅。壳斗科的种子应把壳斗与种子分开，把壳斗归为夹杂物。废种子：能明显识别的空粒、腐坏粒、已萌芽因而显然丧失发芽能力的种子；严重损伤（超过原大小一半）的种子和无种皮的裸粒种子。夹杂物：不属于纯净种子的其它树种的种子；叶片、磷片、苞片、果皮、种翅、壳斗、种子碎片、土
3、块和其他杂质；昆虫的卵块、成虫、幼虫和蛹。如果原测定样品重减去纯净种子、废种子及夹杂物三种成分总重量其差距不超过附表规定时，即可计算净度，否则重做。表1 净度分析样品的总体及各个组成成分的称量精度测定样品重，g称量至小数位数1.0000以下41.0009.999310.0099.992100.0999.911000或1000以上0表2测定净度的容许误差测定样品最大容许误差5克以下0.025100.0511500.10511000.201011500.501512001.00大于2001.50表3 两次测定的平均数容许差距两次测定的平均数容许差距50%100%50%99.95100.000.00
4、0.040.1699.9099.940.050.090.2499.8599.890.100.140.3099.8099.840.150.190.3599.7599.790.200.240.3999.7099.740.250.290.4299.6599.690.300.340.4699.6099.640.350.390.4999.5599.590.400.440.5299.5099.540.450.490.5499.4099.490.500.590.5899.3099.390.600.690.6399.2099.290.700.790.6799.1099.190.800.890.7199.009
5、9.090.900.990.7598.7598.991.001.240.8198.5098.741.251.490.8998.2598.491.501.740.9798.0098.241.751.991.0497.7597.992.002.241.0997.5097.742.252.491.1597.2597.492.502.741.2097.0097.242.752.991.2696.5096.993.003.491.3396.0096.493.503.991.4195.5095.994.004.491.5095.0095.494.504.991.5794.0094.995.005.991.
6、6893.0093.996.006.991.8192.0092.997.007.991.9391.0091.998.008.992.0590.0090.999.009.992.1588.0089.9910.0011.992.3086.0087.9912.0013.992.4784.0085.9914.0015.992.6282.0083.9916.0017.992.7680.008.9918.0019.992.8878.0079.9920.0021.992.9976.0077.9922.0023.993.0974.0075.9924.0025.993.1872.0073.9926.0027.9
7、93.2670.0071.9928.0029.993.3365.0069.9930.0034.993.4460.0064.9935.0039.993.5550.0059.9940.0049.993.65计算方法一般进行净度的测定按下列公式计算：净度 =纯净种子重量/（纯净种子重量+夹杂物重量+异类种子重量） 100%2、果实解剖结构 将风干果实浸水12h后，使用单面刀片解剖，进行解剖结构观察。另将果皮在沸水中蒸沸约45 min以促其软化；将煮沸后的果皮与未处理的种皮分别置于2.5%戊二醛中固定，经系列丙酮脱水，转入乙酸异戊酷后，进行临界点干燥，喷金，在扫描电子显微镜下观察果皮结构和种皮表皮结构
8、特征，并进行记录和拍照。3、果实大小的测定 用游标卡尺分别测量果实的纵径和横径长度，其中以果实的两次垂直横径的平均值作为所测果实的横径。测定样品采用四分法抽取，每次测定数量为100粒。4、种子形态使用游标卡尺测量新鲜种子(即刚成熟新鲜采集的种子)的横轴、纵轴长度及种子厚度(单位均为cm)，每组100粒，计算平均值，重复三次。5、种子千粒重采用四分法测量种子的千粒重，每次取种子100粒称重，重复8次。种子千粒重(g)=(MI+MZ+MS)*1/8*10(注:式中MI、MZ、MS为每次测量的100粒种子的重量，单位为g)。6、种子含水率检测取净种后待测的新鲜种子200粒称重后，放入85烘箱烘干，第
9、一天每隔4h取出迅速称重，以后几天每12h称重一次，直到种子重量恒定，三个重复，取三次重复的平均值(单位为g)计算新鲜种子含水率。7、种子种皮透性测定取净种后待测的新鲜种子，分为完整种子和破皮种子(夹破)两种处理，每种处理三个重复，每个重复50粒种子称重后放入室温下清水中浸泡，第一天每隔2h取出用滤纸吸干表面水分后迅速称重，以后几天每12h测定一次，直到种子吸水达到饱和，每种处理取三次重复的平均值(单位为g)计算完整种子和破皮种子的吸水速率。8、种子生活力检测取新鲜种子于50温水中浸泡48h后，纵向剖开，以不损伤胚而暴露胚为佳。再以0.5%的TTC染液在30的恒温箱中黑暗染色12h，检查胚和胚
10、乳的着色情况以检测种f的生活力，设置重复3次，每重复50粒。四唑染色法介绍：应用2，3，5-三苯基氯化（或溴化）四唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride of bromide）的无色溶液作为指示剂，这种指示剂被种子吸收，在种子组织内与活细胞的还原过程起反应，生成一种红色而稳定的不扩散物质，即三苯基甲肤（triphenyl formazan），染色的是活细胞，未染色的为死细胞。使用氯化（或溴化）四唑的水溶液，浓度随树种而略有不同，见表中的规定。如果所使用蒸馏水的pH值不在6.57.5范围之内，可将四唑溶于缓冲溶液。缓冲溶液的配制方法如下：溶液a-在1 000
11、ml水中溶解9.078g磷酸二氢钾(KH2PO4);溶液b-在1 000ml水中溶解11.876g磷酸氢二钠（Na2 H2PO4o2H2O），或9.472g磷酸氢二钠（Na2 H2PO4）。取溶液a 2份和溶液b 3份混合，配成缓冲溶液。在该缓冲溶液里溶解准确数量的四唑盐，以获得正确的浓度。例如，每100ml缓冲溶液中溶入1g四唑盐即得1%浓度的溶液。最好随配随用。剩余的溶液可在短期内贮于低温15的黑暗条件下。这种溶液可以在室温下保存几个月。取胚：剥去外种皮和内种皮，尽量不使胚乳受到损伤，剥去种皮的种子，先放入盛有清水或垫有湿沙布的器皿中，全部剥完后再放入四唑溶液中，使溶液淹没种胚，上浮者要压
12、沉。挑出空粒、腐坏粒和有病虫害的种粒，并计入附表中。染色：染色时放在黑暗处，保持温度在2530左右最为适宜。染色时间因树种而异，至少6小时。观察记载：到达规定所染色的时间之后倒出溶液，用清水冲洗种胚，立即将种胚放在垫湿沙布的器皿中，保持湿润，以备鉴定。 根据染色的部位、染色面积的大小，判断种子的生活力。并解剖种子，借助手持放大镜逐粒观察胚的染色情，记录附表中。9、种子抑制物的分析抑制物提取 分别称取在33一35条件下干燥至恒重的果皮、果肉、外种皮、中种皮和胚乳粉末（过lmm筛粉碎机粉碎）各2.5g于研钵中，用5ml80%甲醇研磨，将研磨液分别倒入50ml试管中，再各以80%甲醇清洗研钵3次，清
13、洗液与研磨液合并于同一试管中，最后分别以80%甲醇定容至50ml，振荡均匀。试管中的浸提液于4下密闭浸提24h，期间振荡4一5次。24h后取出试管，于44000rpm条件下离心15min，上清液分别倒入小烧杯中，沉淀再以80%甲醇定容至50ml，搅拌并振荡充分混合，于4下再次浸提，操作同第一次浸提，重复三次，分别合并三次浸提液，将装有浸提液的烧杯，放在35的气候箱中蒸发浓缩，待甲醇挥发干净后再以蒸馏水分别定容至5Oml，即得到种子各部分萌发抑制物的浸提液原液。生物学鉴定 将浸提液原液分别稀释至10%、25%、50%、75%、100%，以蒸馏水为对照，在12cm直径的培养皿中放2层滤纸，分别加入5ml不同部位的、不同浓度的浸提液浸透滤纸，每皿摆放50粒白菜种子做萌发试验，各重复3次。24h、48h分别统计发芽率，72h测量苗高与根长(单位cm)。（白菜籽置床前先在45一50水浴中温浸10min，不时搅拌。取白菜种子各25粒均匀摆放在滤纸中上部，培养皿放置时倾斜45“，(28士l)恒温黑暗培养。12h后统计发芽率(以幼根伸出长度大于种子直径为发芽标准)，72h后测量苗高和幼根长。3次重复并进行差异显著性检验）。7
