《基因工程实验指导邢万金 扈廷茂 编写内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程实验指导邢万金 扈廷茂 编写内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室.doc（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因工程实验指导邢万金 扈廷茂 编写2005年6月（第二次修订）内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室目 录基因工程实验注意事项（2）实验流程参考图（3）第一部分 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一 质粒DNA的小量制备（4）实验二 质粒DNA电泳鉴定（6）实验三 质粒DNA的酶切（8）第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建实验四 PCR扩增制备目的基因（10）实验五 目的基因片段与载体连接（12）实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断（14）第三部分 感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定实验七 感受态菌的制备（16）实验八 细菌转化（18）实验九 转化克隆的筛选和鉴定（20）第四部分 目的
2、基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定实验十 外源基因的诱导表达（22）实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白（24）附 录附录1：表达载体pET-His的相关资料（27）附录2：从NIH查阅的nattokinase（纳豆激酶）序列之一（28）附录3：本实验所用的克隆载体图（29）基因工程实验注意事项1 上实验课的学生每两人分为一个小组。2 课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。认真填写本科基因工程实验论文开题报告，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。3 实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应
3、根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。4 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。5 本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在10天之内完成。6 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！7 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。8 写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。9 在实验室内不能大声喧哗。10在实验的过程中制造的任
4、何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。11实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。12 值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。13实验时损坏的任何物品都要及时申报。PCR扩增NK提质粒pMD18-T-NK，pET-his，11ppMD18-TppMD18-TEcoRI+BamHI酶切回收pET-hispET-hispMD18-T-NK实验流程参考图制备感受态菌DH5a, BL21（DE3）与pUCm-T连接转化DH5a筛选鉴定提重组质粒pUCm-T-NKEc
5、oRI+BamHI酶切回收NK片断重组质粒pET-his-NKIPTG诱导表达SDS-PAGE检测转化DH5a与pET-his连接DH5aBL21（DE3）筛选鉴定提重组质粒pET-his-NK转化BL21（DE3）重组质粒pUCm-T-NK第一部分 质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一 质粒DNA的小量制备1目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
6、当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。4试剂 pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70
7、%乙醇，TE buffer（pH8.0）。5实验准备 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100m
8、l），70%乙醇（-20C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。6操作步骤（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。（2） 从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将
9、菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。 pET-his菌： 接种于5ml LB（Amp+）； pMD18-T菌：接种于2ml LB（Amp+）（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 pET-his菌： 3管（31.5ml）； pMD18-T菌：1管（1.5ml）（4） 在沉淀中加入100ml 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5） 加入200
10、ml 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6） 加入150ml 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400ml 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800ml 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8） 15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9） 再加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡
11、旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10） 离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11） pMD18-T加入30ml 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管pET-his质粒中每管加入10ml蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1ml RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12） 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告
12、7思考（1） 影响本实验结果的因素有哪些？实验二 质粒DNA电泳鉴定1目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4试剂 pET-his质粒，pMD18-T-NK载体，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子
13、量标准（lDNA HindIII: 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp）。 5实验准备 配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4C避光储存），10加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6操作步骤（1） 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml 正好倒两块小胶。（2） 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。（4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒
