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1、 环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3表达的影响 作者：王云，魏旭峰，顾继伟，李庆新，陈瑜，易定华 【摘要】 目的 探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶1、3(matrix metalloproteinase1、3, MMP1、3)表达的影响。方法 采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组，用30g/L环氧氯丙烷处理24h的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)种植于脱细胞支架上的组织工程心脏瓣膜(tissue enginee
2、ring heart valve, TEHV)，分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构，并行RTPCR测定hBMSCs分泌MMP1、3的功能。结果 hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMPs的表达比对照组降低。结论 环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架，可以抑制hBMSCs的MMP1、3的表达。 【关键词】 环氧氯丙烷；基质金属蛋白酶；组织工程心脏瓣膜；降解代谢 ABSTRACT: Objective To evaluate the effects of epoxy chloropropane on the expression of matrix metall
3、oproteinase 1 and 3 in creating tissue engineering heart valves. Methods The porcine aortic valve leaflets were digested by using detergent and trypsin as control group, and those decellularized leaflets treated with 3% epoxy chloropropan for 24 hours were the experimental group. The cultured human
4、bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) were seeded onto the decellularized scaffolds of TEHV. The histological study was conducted with pathological sections and scanning electron microscopy. And reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the expression of MMP1 an
5、d 3. Results In the experimental group, the histology showed that the hBMSCs grew well into the pores and formed a confluent layer in decellularized scaffolds; RTPCR indicated significantly attenuated expression of MMP1 and 3 compared with the control (P KEY WORDS: epoxy chloropropane; matrix metall
6、oproteinase; tissue engineering heart valve; degradation 生物瓣膜长期植入人体后的钙化使其易于衰坏，影响了生物瓣的广泛应用12。其细胞外基质成分会受到内源性蛋白水解酶和宿主蛋白水解酶的降解，这可能是生物瓣膜衰坏和钙化的原因之一。细胞外基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是最主要的蛋白水解酶，多种细胞分泌MMPs。环氧氯丙烷(epoxy chloropropane, EC)是经筛选的生物瓣膜防钙化剂。动物实验证明EC能使戊二醛处理的瓣膜钙化明显减轻，仅为对照组的1/317，且瓣膜的力学性能和组织稳定
7、性良好34。在组织工程瓣膜研究中，应用EC处理脱细胞猪瓣支架材料毒性低，初步实验研究证实种子细胞能够生长。本文通过RTPCP技术测定两组MMP1和MMP3基因的表达情况，比较去垢剂和胰蛋白酶共同消化以及加用EC处理这两种不同方法，并对后者的作用予以评价。 1 材料与方法 动物和试剂 猪心30个购自西安肉联厂，DF12培养基和FCS购自Gibco公司，鼠抗人SMA抗体购自Sigma公司，Vimentin抗体购自Neomaerker公司，辣根酶标记山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，含10%(体积分数)FCS的DF12培养液，青霉素80u/mL，链霉素100u/mL。 人BMSCs的分
8、离和培养 人BMSCs来源于5名先天性心脏病患者，平均年龄(4)岁，均为家属知情同意。胸骨劈开后，在胸骨断面负压吸引，用预置10mL肝素盐水(200u/mL)的注射器吸取10mL骨髓，充分混匀，400g离心5min，弃去脂肪层，分别沿管壁注入2支含10mL Percoll分离液(密度为/mL)的一次性离心管内，立即1000g离心20min；抽取界面处细胞悬液，400g离心5min；弃上清，吹打成细胞悬液，接种于75cm2培养瓶，加入DF12培养液，置于37恒温保湿培养箱中培养。24h与72h换液，逐步除去未贴壁细胞，此后每3d换液一次。当细胞达90%融合时，以/L胰酶消化传代，取第二代细胞行细
9、胞表型鉴定，第三代以后的用于瓣膜种植。 细胞表型的鉴定 取第二代细胞接种于预入盖玻片的75cm2培养瓶中，贴壁3h后加入DF12培养液，次日取出玻片，PBS液冲洗3次，40g/L多聚甲醛固定。按常规免疫组化方法，加入鼠抗人Vimentin及SMA抗体，DAB试剂盒显色鉴定细胞表型。 脱细胞猪主动脉瓣支架的制作 清洁条件下，取出猪主动脉瓣，将新鲜瓣叶加入含1g/L胰酶及双抗溶液(100u/mL青霉素及100g/mL链霉素溶液)的PBS液于25水浴摇床中连续振荡12h，制备猪脱细胞主动脉瓣支架5。含双抗的PBS液冲洗脱细胞猪瓣后取样，于40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片常规HE染色行组织学检查，
10、其余瓣叶置于灭菌的广口瓶中，封口后送钴源室辐照消毒(Co6012000Gy照射12h)，常温保存备用。 TEHV的构建 将脱细胞瓣叶放入12孔板中(每孔1片)，以FCS浸泡24h，滴种BMSCs细胞悬液(1105/cm2)，贴壁3h后加入适量培养液，培养7d，每天换液一次。 组织学的检查 取出TEHV瓣叶，PBS液轻轻冲洗后分2组(每组6片)，以40g/L多聚甲醛固定，行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜检查。 RTPCR检测 按总RNA 抽提的程序进行总RNA抽提(RNA抽提试剂盒购自TaKaRa生物公司)。分别设计并合成特异性扩增MMP1和MMP3基因的寡核苷酸引物，用RTPCR试剂盒(TaK
11、aRa)进行扩增。MMP1(346bp)正义与反义两条引物的序列分别为：5CATCGTGTTGCGGCTCAT3，5GCCCATTTGGCAGTTGTG3。MMP3(312bp)正义与反义两条引物的序列分别为：5AGTTTGCTCAGCCTATCC3，5CTGTATGTAAGGTGGGTTT3。扩增反应条件为：逆转录42、1h；PCR 94、5min；94、30s；60、45s；72、60s；72、5min共35个循环。理论上扩增片段大小分别位于346bp及312bp。 PCR产物分析 分别取6L产物，于10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。用actin(310bp)作为内对照，上下游引物分别为：5A
12、TCATGTTTGAGACCTTCAA3，5CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3。用Labwork软件进行半定量分析，测定其相对含量。 统计学处理 利用SPSS软件进行统计学分析，所有数据用s表示，两组间比较用t检验。 2 结果 BMSCs的培养及分化 BMSCs原代培养24h后基本完全贴壁，48-72h即可见克隆形成，细胞逐渐呈梭形，8-12d已达80%融合。传代培养的细胞数小时后贴壁并伸展成多角形、梭形，3-5d完全融合，传代细胞Vimentin及SMA染色阳性(图1、2)。 脱细胞支架的组织学结构 瓣叶表面及中间的细胞成分完全去除，胶原纤维及弹力纤维结构完整、呈波浪状(图3)。 T
13、EHV的组织学和扫描电镜检查 实验组与对照组相比，HE染色显示BMSCs分化细胞在脱细胞支架上呈复层生长，细胞间有基质形成。脱细胞支架表面为致密细胞层覆盖，细胞呈梭形，排列有序(图4-7)。 MMP1和MMP3的mRNA表达 RTPCR产物经琼脂糖电泳分析显示MMP1和MMP3扩增片段分别位于为346bp和312bp。实验组与对照组相比，培养的hBMSCs在两基因的mRNA表达方面均降低，有明显差异(P The immunohistochemistry of hBMSCs showed positive vimentin antibody (200) 图2 骨髓干细胞免疫组化染色显示平滑肌抗体
14、阳性（略） The immunohistochemistry of hBMSCs showed positive SMA (200) 图3 脱细胞猪主动脉瓣叶的组织结构（略） The hematoxylin and eosin staining of decellularized porcine aorta valve leaflets (400) 图4 实验组构建的TEHV的HE染色结果（略） The hematoxylin and eosin staining of TEHV on the experimental group (400) 图5 对照组构建的TEHV的HE染色结果（略） T
15、he hematoxylin and eosin staining of TEHV on the control group (400) 图6 实验组构建的TEHV的扫描电镜结果（略） The scanning electron microscope section of TEHV on the experimental group (1500) 图7 对照组构建的TEHV的扫描电镜结果（略） The scanning electron microscope section of TEHV on the control group (1500) 图8 两组分别构建的TEHV的RTPCR结果（略） The results of RTPCR on TEHV in two groups M: marker; Line 3, 6: blank; Line 1,4,7: products of MMP1, 3 and actin in the control group; Lane 2,5,8: products of MMP1, 3 and act
